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BAFF受体TACI融合蛋白的表达纯化与功能研究

作　者: 孟祥斌
导　师: 孙剑
学　校: 天津大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: BAFF TACI-Trx B-cell lymphoma 融合蛋白 拮抗剂
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


B细胞活化因子(B cell activating factor,BAFF)属于肿瘤坏死因子超家族的一员。它是外周B细胞存活的重要因子。在动物模型中,BAFF的过表达会导致自身免疫病样症状的发生。研究发现,在不同类型的自身免疫性疾病患者的血清中,BAFF的含量是明显升高的。近期研究还发现BAFF还与部分肿瘤疾病的发生有关。因此,BAFF的拮抗剂可能成为治疗自身免疫疾病和某些肿瘤的新型药物。由于BAFF和受体TACI具有高亲和力,可特异性识别BAFF并与之结合,因此体外构建表达的TACI可中和体内过表达的BAFF,抑制B细胞的增殖和活化,缓解和治疗与BAFF相关的自身免疫病和B细胞肿瘤。本课题的研究为开发BAFF拮抗剂治疗BAFF相关疾病提供了实验基础。本课题研究方法:对BAFF受体TACI融合蛋白原核表达与纯化,在体外研究TACI对B系淋巴瘤细胞增殖的影响,并初步分析了TACI抑制肿瘤细胞系增殖的机理。主要研究结果:(一)TACI融合蛋白原核表达纯化:本实验室已将钓取的TACI基因片段连接到原核表达载体pET-32a上。将重组正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta,获得TACI表达工程菌。经IPTG诱导,融合蛋白利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化。(二)TACI抑制B系淋巴瘤细胞系细胞的增殖:某些B系淋巴瘤细胞系表达BAFF及其受体,并且通过自分泌BAFF来促进肿瘤细胞的增殖。可溶性TACI蛋白能够通过特异性阻断BAFF抑制B系淋巴瘤细胞系的增殖,并且具有剂量依赖性。(三)TACI抑增殖的机理:TACI能够将Daudi细胞阻滞在DNA合成期(即S期) ,而且具有一定的剂量依赖性。TACI对Daudi细胞增殖抑制作用,主要是通过调控细胞周期,而非凋亡达到抑增殖效果。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章 文献综述  7-15
  1.1 BAFF及其受体  7-11
    1.1.1 BAFF的结构  7-8
    1.1.2 BAFF的受体  8-9
    1.1.3 BAFF及其受体的分布  9
    1.1.4 BA FF及其受体缺失的小鼠表型  9-11
  1.2 BAFF的信号通路  11-12
  1.3 BAFF与人类疾病  12-13
    1.3.1 BAFF与自身免疫病  12-13
    1.3.2 BAFF与肿瘤疾病  13
  1.4 BAFF拮抗剂的研究进展  13-15
第二章 可溶性TACI蛋白的表达、纯化与鉴定  15-24
  2.1 引言  15
  2.2 材料与仪器  15-17
    2.2.1 材料  15-17
    2.2.2 仪器  17
  2.3 方法  17-21
    2.3.1 可溶性TACI的表达、纯化  17-19
    2.3.2 可溶性TACI蛋白的纯化与浓度测定  19-20
    2.3.3 可溶性TACI蛋白的Western鉴定  20
    2.3.4 可溶性TACI与BAFF体外结合实验  20-21
  2.4 结果与讨论  21-23
    2.4.1 可溶性TACI蛋白的表达与纯化  21-22
    2.4.2 蛋白浓度测定  22-23
    2.4.3 可溶性TACI蛋白的Western鉴定  23
    2.4.4 可溶性TACI与BAFF体外结合实验  23
  2.5 小结  23-24
第三章 TACI对B系淋巴瘤细胞系增殖功能影响  24-33
  3.1 引言  24
  3.2 材料与仪器  24-25
    3.2.1 材料  24
    3.2.2 仪器  24-25
  3.3 方法  25-28
    3.3.1 B系肿瘤细胞系中BAFF表达情况检测  25-26
    3.3.2 B系淋巴瘤细胞系BAFF及其受体表达检测  26
    3.3.3 BAFF siRNA干扰实验  26-27
    3.3.4 TACI对肿瘤细胞增殖抑制实验（CCK-8 法）  27-28
    3.3.5 外源BAFF促B系肿瘤细胞增殖回复试验  28
  3.4 结果与讨论  28-33
    3.4.1 B系肿瘤细胞系中BAFF表达情况  28
    3.4.2 B系淋巴瘤细胞系BAFF及其受体表达检测  28-29
    3.4.3 BAFF siRNA干扰实验  29-30
    3.4.4 TACI对肿瘤细胞增殖抑制实验（CCK-8）  30-33
第四章 TACI抑制B系淋巴瘤细胞系增殖的机理初步探讨  33-41
  4.1 引言  33
  4.2 材料与仪器  33-34
    4.2.1 材料  33
    4.2.2 仪器  33-34
  4.3 方法  34-35
    4.3.1 细胞凋亡实验（Annexin V）  34
    4.3.2 细胞周期分析（PI方法）  34-35
    4.3.3 细胞周期分析（BrdU掺入）  35
  4.4 结果与讨论  35-41
    4.4.1 TACI对细胞凋亡的影响  35-36
    4.4.2 TACI对Daudi细胞周期影响分析  36-39
    4.4.3 TACI对Daudi细胞周期影响分析（BrdU掺入）  39-41
第五章 结论与展望  41-42
  5.1 结论  41
  5.2 展望  41-42
参考文献  42-48
发表论文和科研情况说明  48-49
附录  49
缩写一览表  49-50
致谢  50

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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