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TLR3基因在BeWo细胞HBV感染和清除中的作用
作 者: 郭珍
导 师: 王素萍
学 校: 山西医科大学
专 业: 流行病与卫生统计学
关键词: 乙肝病毒 TLR3 BeWo PolyI:C 细胞因子
分类号: R512.62
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 24次
引 用: 0次
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内容摘要
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目的:①探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的BeWo细胞后,各组BeWo细胞TLR3蛋白表达与HBV感染与复制的关系;②探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的BeWo细胞后,各组BeWo细胞分泌TLR3信号转导过程中相关细胞因子的水平与HBV感染与复制的关系。方法:①利用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将抑制TLR3基因的质粒pEGFP-Genesil-tlr3转染入BeWo细胞,以下调BeWo细胞的TLR3表达;用40ug/mlPolyI:C刺激BeWo细胞以上调TLR3蛋白的表达,然后用HBV感染各组细胞;②本次实验采用BeWo细胞与100ul HBV DNA含量为5.0×106(copies/ml)的病人血清共同培养作为HBV感染的方法,共设立四个组:正常对照组、HBV刺激正常细胞组、HBV刺激抑制TLR3质粒转染组、PolyI:C+HBV刺激组,于HBV刺激各组细胞8h、16h、24h、48h后收集各组细胞的培养上清及细胞进行下一步实验;③用流式细胞术(FACS)测定以上各组细胞TLR3蛋白的表达量,并分析不同HBV刺激时间点下TLR3蛋白表达水平的变化;用荧光定量PCR法检测HBV刺激后各组细胞培养上清中的HBV DNA载量;④用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞培养上清中IL-10、TNF-α、IFN-β的表达。结果:①PolyI:C刺激BeWo细胞后,TLR3蛋白表达量增加,其平均荧光强度为65.11±2.73,正常对照组细胞为53.27±4.45,差异有统计学意义(t=-4.536,P<0.05)。②将抑制TLR3的质粒(pEGFP-Genesil-tlr3)用脂质体转染法转染入BeWo细胞后,其平均转染效率为50.24%。③用FACS检测不同时间点(8h、16h、24h、48h)HBV刺激各组BeWo细胞的TLR3蛋白表达量,其在四个实验组中的4个不同时间点上差异均有统计学差异(P<0.05)。正常对照组BeWo细胞在4个时间点上TLR3蛋白平均荧光强度分别为52.88、53.78、55.07、54.70;HBV刺激BeWo细胞可使TLR3蛋白水平升高,在8h为62.50,16h为69.65,24h为71.78,48h为73.49,且随时间变化TLR3蛋白表达水平有升高趋势;PolyI:C +HBV刺激组TLR3蛋白表达量高于正常对照组及HBV刺激正常细胞组,8h为77.27,16h为85.36,24h为91.26,48h为88.27,在24h时TLR3蛋白表达量达到高峰;HBV刺激抑制TLR3质粒转染组TLR3蛋白表达量先下降再升高,其在8h为46.19,16h为45.96,24h为46.34,48h为49.55,与正常对照组相比,除在48h差异无统计学意义(P>0.05)外,其他时间点均有统计学差异(P<0.05)。④用荧光定量PCR法检测HBV刺激正常细胞组、PolyI:C+HBV刺激组和HBV刺激抑制TLR3质粒转染组的不同HBV刺激时间点(8h、16h、24h、48h)上各组细胞培养上清中HBV DNA拷贝数,结果显示三组间差异在4个时间点上均有统计学意义(P<0.05),且各组均随着HBV刺激时间的延长,HBV DNA拷贝数降低。与HBV刺激正常组相比,PolyI:C+HBV刺激组HBV DNA拷贝数较低,HBV刺激抑制TLR3质粒转染组的HBV DNA拷贝数较高。⑤在HBV刺激的4个时间点(8h、16h、24h、48h)上,PolyI:C+HBV刺激组分泌细胞因子IL-10、TNF-α、IFN-β的水平比HBV刺激正常细胞组高,差异均有统计学意义(P<0.05);HBV刺激质粒转染组分泌的细胞因子水平低于HBV刺激正常细胞组,不同时间点上差异也均有统计学意义(P<0.05)。随着HBV刺激时间的延长,TNF-α表达水平在8h开始上升,24h达到高峰后开始下降;IL-10和IFN-β的表达水平在PolyI:C+HBV刺激组16h后上升幅度较大,其余各组上升较为缓慢。结论①HBV刺激BeWo细胞后其TLR3蛋白表达增加;PolyI:C上调BeWo细胞TLR3蛋白表达水平后在HBV刺激下,TLR3蛋白表达量进一步升高;抑制TLR3质粒转染的BeWo细胞在HBV刺激下TLR3蛋白表达量降低;同时HBV刺激后各组细胞培养上清中HBV DNA拷贝数随着TLR3蛋白表达量的升高而降低,从而说明TLR3在清除HBV感染与抑制HBV复制中起到重要作用。②HBV刺激能诱导BeWo细胞分泌细胞因子IL-10、TNF-α和IFN-β,PolyI:C刺激增强了BeWo细胞分泌细胞因子的能力,抑制TLR3质粒转染的BeWo细胞在HBV刺激下其细胞因子分泌能力下降,说明TLR3是通过诱导BeWo细胞分泌其相关信号转导途径的细胞因子而发挥抗HBV感染的能力。
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全文目录
常用缩写词中英文对照表 6-7
中文摘要 7-9
Abstract 9-11
前言 11-14
第一章 TLR3 在HBV感染不同TLR3基因状态BeWo细胞中的作用研究 14-30
1 材料 14-16
1.1 实验用细胞和质粒的制备 14
1.2 研究对象和实验分组 14
1.3 主要试剂 14-15
1.4 主要仪器 15
1.5 主要试剂的配制 15-16
2 方法 16-20
2.1 BeWo细胞的培养 16-18
2.2 质粒的小量提取和浓度测定 18-19
2.3 脂质体转染法将抑制TLR3 质粒转染入BeWo细胞的转染效率 19
2.4 流式细胞仪检测各组细胞TLR3 的表达 19-20
2.5 HBV DNA定量检测 20
2.6 统计分析方法 20
3 结果 20-27
3.1 各组BeWo细胞的形态学表现 20-23
3.2 PolyI:C刺激对BeWo细胞TLR3 蛋白表达的影响 23
3.3 抑制TLR3 质粒转染入BeWo细胞的转染情况 23
3.4 HBV刺激各组BeWo细胞后TLR3 蛋白的表达情况 23-24
3.5 荧光定量PCR测定各组的HBV DNA 24-27
4 讨论 27-30
第二章 TLR3 信号转导相关细胞因子的表达与BeWo细胞HBV感染的关系 30-37
1 材料和方法 30-31
1.1 研究对象和实验分组 30
1.2 主要试剂和仪器 30
1.3 实验方法 30-31
1.4 统计分析方法 31
2 结果 31-34
2.1 相关细胞因子的标准曲线绘制 31-32
2.2 HBV刺激后各组细胞TNF-α（Th1）细胞因子的表达 32-33
2.3 HBV刺激后各组细胞IL-10（Th2）细胞因子的表达 33-34
2.4 HBV刺激后各组细胞IFN-β细胞因子的表达 34
3 讨论 34-37
全文小结 37-38
参考文献 38-43
综述 43-51
参考文献 49-51
个人简介 51-52
致谢 52
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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性肝炎 > 乙型肝炎
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