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重组蛋白GGH的分离纯化及药效学初步评价

作　者: 李现丽
导　师: 许正宏
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: GLP-1 融合蛋白GGH 分离纯化药效学
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 36次
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内容摘要

胰高血糖素样肽-1由肠道L细胞合成和分泌的一个30个氨基酸的多肽,它不仅能刺激胰岛β细胞增殖、抑制β细胞凋亡,而且延缓胃排空和抑制食欲。但其在体内的半衰期只有2~6 min,大大限制了其应用。为克服GLP-1半衰期短的缺点,实现其在体内的长效作用,本实验室成功构建了胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)与人血清白蛋白的融合体(GGH),本文对表达成功的融合蛋白GGH进行分离纯化的优化和药效学初步评价,主要结论如下:融合蛋白GGH分离纯化步骤:发酵液8000 r/min离心8 min,0.65μm的微滤膜微滤,采用截留分子量为10 kDa的超滤膜超滤20倍,依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25层析柱,得到的目的蛋白经过HPLC和SDS-PAGE检测纯度达到98.48%以上,回收率为28.9%,内毒素含量10 EU/mg。口服糖耐量实验,评价融合蛋白GGH的最小有效量、最大剂量的耐受性、静脉注射给药时的量-效关系,皮下注射给药时的量-效和时-效关系。静脉给药在剂量1.0 mg/Kg~6.0 mg/Kg范围内、皮下注射给药GGH(2.0、4.0、6.0 mg/Kg)做量-效关系的对数曲线,成线性关系;提前8 h皮下注射给药降低葡萄糖负荷后血糖升高的量-效关系最好。融合蛋白GGH对C57BL/6小鼠β细胞损伤模型和正常C57BL/6小鼠胃排空模型进行药效学初步评价。与模型对照组相比,融合蛋白GGH(2.0、6.0、18.0 mg/Kg)可以显著提高β细胞损伤模型小鼠的胰岛素水平;降低小鼠的饮食量、饮水量和尿量;促进肝/肌糖原的合成,降低血糖水平;免疫组化结果显示融合蛋白GGH可以促进胰岛β细胞的增殖、刺激胰岛素的表达、抑制胰高血糖素的表达。融合蛋白GGH(2.0、4.0、6.0 mg/Kg)可以显著降低正常C57BL/6小鼠的胃排空和延缓肠推进。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-18
  1.1 糖尿病的发病机理及治疗策略  8-9
    1.1.1 糖尿病的发病机理  8
    1.1.2 糖尿病的治疗策略  8-9
  1.2 GLP-1 生理功能  9-11
    1.2.1 GLP-1 对胰岛功能的影响  9-10
    1.2.2 GLP-1 刺激胰岛素分泌和增加胰岛素的敏感性  10-11
    1.2.3 GLP-1 抑制胰高血糖素的分泌  11
    1.2.4 GLP-1 降低外周血糖  11
    1.2.5 GLP-1 对食欲和胃排空的作用  11
  1.3 GLP-1 的长效性研究  11-12
  1.4 重组人血清白蛋白的分离纯化方法  12-14
    1.4.1 重组人血清白蛋白的粗分离阶段  13
    1.4.2 重组人血清白蛋白的精细分离阶段  13-14
    1.4.3 重组人血清白蛋白纯化的发展趋势  14
    1.4.4 重组蛋白GGH 纯化工艺进展  14
  1.5 糖尿病动物模型  14-15
    1.5.1 化学药物诱导的动物模型  15
  1.6 本课题研究的意义和内容  15-18
    1.6.1 本课题研究的意义  15
    1.6.2 本课题的研究内容  15-18
第二章融合蛋白GGH 的分离纯化  18-32
  2.1 引言  18
  2.2 材料与方法  18-22
    2.2.1 材料和试剂  18-19
    2.2.2 主要仪器  19
    2.2.3 分离纯化方法  19-21
    2.2.4 纯度检测方法  21-22
  2.3 结果与讨论  22-30
    2.3.1 超滤浓缩  22
    2.3.2 Blue Sepharose 6 Fast Flow 层析  22-24
    2.3.3 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)层析  24-26
    2.3.4 Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析  26-27
    2.3.5 凝胶Sephadex G-25 层析  27-28
    2.3.6 融合蛋白GGH 纯化工艺  28-29
    2.3.7 融合蛋白的Western Blotting 鉴定  29
    2.3.8 融合蛋白的纯度鉴定  29-30
  2.4 本章小结  30-32
第三章融合蛋白GGH 对正常C57BL/6 小鼠量-效和时-效关系  32-40
  3.1 引言  32
  3.2 材料与方法  32-33
    3.2.1 主要试剂和仪器  32
    3.2.2 实验动物  32-33
  3.3 实验方法  33-34
    3.3.1 静脉给药的最小有效量  33
    3.3.2 静脉给药的量-效关系  33
    3.3.3 皮下给药的时-效关系  33
    3.3.4 正常小鼠空腹血糖的影响  33
    3.3.5 正常小鼠最大剂量的耐受性  33-34
    3.3.6 融合蛋白GGH 对正常C57BL/6 食欲和胃排空的影响  34
    3.3.7 统计学分析  34
  3.4 结果与讨论  34-39
    3.4.1 最小有效量  34-35
    3.4.2 静脉给药的量-效关系  35
    3.4.3 皮下给药的时-效关系  35-37
    3.4.4 对正常小鼠空腹血糖的影响  37-38
    3.4.5 最大剂量的耐受性  38
    3.4.6 食欲、胃排空和肠推进的影响  38-39
  3.5 本章小结  39-40
第四章融合蛋白GGH 对模型小鼠的药效学评价  40-52
  4.1 引言  40
  4.2 材料与方法  40-41
    4.2.1 材料与试剂  40
    4.2.2 主要仪器  40-41
    4.2.3 主要试剂  41
    4.2.4 实验动物  41
  4.3 实验方法  41-43
    4.3.1 β细胞损伤动物模型的建立与给药观察  41-42
    4.3.2 组织学标本制备及HE 染色  42-43
    4.3.4 统计学分析  43
  4.4 结果与分析  43-51
    4.4.1 融合蛋白GGH 对模型小鼠空腹血糖的影响  43-44
    4.4.2 融合蛋白GGH 对模型小鼠体重、饮食和饮水量的影响  44-45
    4.4.3 融合蛋白GGH 对模型小鼠血清胰岛素水平的影响  45-46
    4.4.4 融合蛋白GGH 对模型小鼠肝糖原和肌糖原的影响  46-47
    4.4.5 融合蛋白GGH 对胰岛组织病理学的改变  47-51
  4.5 本章小结  51-52
结论与展望  52-54
致谢  54-56
参考文献  56-60
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  60

重组蛋白GGH的分离纯化及药效学初步评价

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