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重组枯草芽孢杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱的研究

作　者: 彭艳红
导　师: 石贵阳
学　校: 江南大学
专　业: 生物化工
关键词: 枯草芽孢杆菌羰基还原酶整合 cre-loxp系统生物转化
分类号: TQ463
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 63次
引　用: 1次
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内容摘要

麻黄碱(Ephedrine),由于具有较大的药理作用,广泛应用于临床医疗中。利用生物转化法制备光学纯的麻黄碱具有反应条件温和,立体选择性较高等优点,是生产麻黄碱的理想途径之一,具有较大发展潜力;但是该生物转化过程中需要辅酶来提供还原力。本论文着眼于本研究室前期遇到的生物转化过程中辅酶再生的问题,以自身含有葡萄糖脱氢酶GDH的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为宿主,构建羰基还原酶基因mldh游离表达菌株及整合型表达菌株,以实现mldh在枯草芽孢杆菌中的表达并通过细胞内的GDH完成辅酶的再生。本文以B. subtilis Wb600为宿主,枯草芽孢杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件,将羰基还原酶基因mldh连同表达元件一起连接至枯草芽孢杆菌载体pHY300plk上得到质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD;进一步将该重组质粒转化入B. subtilis Wb600中获得游离表达菌株B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh -TrpsD)。对此游离表达菌株进行全细胞生物转化反应实验发现,在葡萄糖存在的情况下,其可转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(简称MAK)生成d-伪麻黄碱;0.2 g培养时间为12 h的游离表达菌株湿菌体,加入0.4 mg的MAK和18 mg的葡萄糖转化反应,产量最高达97.5 mg/L,底物摩尔转化率为24.1%。之后以枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因amyE为整合位点,pUB110上kan为抗性标记基因;构建kan两端含有loxp位点的整合表达载体pUC19-5E-pmt-loxpkan-3E;将该载体转化入B. subtilis Wb600中获得菌株B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxpkan-3E)。再以质粒pSH47为模板扩增CRE重组酶基因cre,枯草芽孢杆菌PxylR基因为启动子,构建表达质粒pHY300plk-PxylR-cre-trpsD ;将该载体转化入B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxpkan-3E),木糖诱导cre基因表达,敲除抗性基因kan;再通过传代培养丢失质粒pHY300plk-PxylR-cre-trpsD,最终得到整合型表达菌株B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxp-3E)。对该整合型重组菌B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxp-3E)进行全细胞转化反应实验,结果0.2 g培养时间为12 h的整合型重组菌湿菌体,加入0.3 mg的MAK和6 mg的葡萄糖转化反应,d-伪麻黄碱产量为47.2 mg/L,底物摩尔转化率为15.5%。本研究成功将外源基因mldh整合到枯草芽孢杆菌染色体上,实现了目的基因在宿主菌中的稳定表达,并完成辅酶的再生。研究结果为利用重组B. subtilis生物转化生产d-伪麻黄碱进行了有益探索。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-8
第一章绪论  8-16
  1.1 手性化合物概述  8
    1.1.1 手性化合物  8
    1.1.2 手性化合物的制备  8
  1.2 麻黄碱概述  8-10
    1.2.1 麻黄碱简介  9
    1.2.2 麻黄碱的应用  9
    1.2.3 麻黄碱的生产方法与研究现状  9-10
  1.3 枯草芽孢杆菌表达系统  10-13
    1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统的特点  10-11
    1.3.2 羰基还原酶基因mldh 在枯草芽孢杆菌中的密码子偏好性分析  11
    1.3.3 枯草芽孢杆菌整合表达  11-13
  1.4 研究思路及研究内容  13-16
    1.4.1 已有研究基础  13
    1.4.2 研究思路及研究意义  13-14
    1.4.3 研究内容  14-16
第二章材料与方法  16-28
  2.1 材料  16-18
    2.1.1 菌株与质粒  16-17
    2.1.2 主要生化和分子生物学试剂  17
    2.1.3 培养基  17
    2.1.4 需配试剂溶液  17-18
    2.1.5 主要设备和仪器  18
  2.2 方法  18-28
    2.2.1 Bacillus subtilis W6600 染色体DNA 的提取  18
    2.2.2 常规分子生物学基因操作  18
    2.2.3 基因的PCR 扩增  18
    2.2.4 游离表达载体pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD 的构建  18-19
    2.2.5 整合表达载体pUC19-5E-pmt-loxpkan-3E 的构建  19-22
    2.2.6 表达载体pHY300plk-PxylR-cre-trpsD 的构建  22
    2.2.7 枯草芽孢杆菌化学感受态制备及转化  22-23
    2.2.8 细胞裂解液的制备  23-24
    2.2.9 SDS-PAGE 检测  24
    2.2.10 重组菌生物转化反应及检测  24
    2.2.11 游离表达菌株B. subtilis W6600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)的构建  24
    2.2.12 游离表达菌株B. subtilis W6600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)全细胞不对称还原反应  24-25
    2.2.13 整合表达菌株B. subtilis W6600 (5E-pmt-loxpkan-3E)的构建  25
    2.2.14 枯草芽孢杆菌cre-loxp 系统的构建及整合表达菌株抗性基因的敲除  25-27
    2.2.15 整合型菌株B. subtilis W6600 (5E-pmt-loxp-3E)全细胞不对称还原反应  27
    2.2.16 游离表达菌株与整合型菌株的比较  27-28
第三章结果与讨论  28-44
  3.1 游离表达菌株B. subtilis W6600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)的构建及其全细胞不对称还原反应  28-33
    3.1.1 载体pHY300plk-PrpsD-TrpsD 的构建  28
    3.1.2 游离表达载体pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD 的构建  28-29
    3.1.3 游离表达菌株B. subtilis W6600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)的鉴定  29-31
    3.1.4 游离表达菌株B. subtilis W6600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)全细胞不对称还原反应  31-33
  3.2 整合表达菌株B. subtilis W6600 (5E-pmt-loxpkan-3E)的构建  33-37
    3.2.1 载体pUC19-5E 的构建  33-34
    3.2.2 载体pUC19-5E-3E 的构建  34
    3.2.3 载体pUC19-5E-pmt-3E 的构建  34-35
    3.2.4 整合表达载体pUC19-5E-pmt-loxpkan-3E 的构建  35
    3.2.5 整合表达菌株B. subtilis W6600 (5E-pmt-loxpkan-3E)的鉴定  35-37
  3.3 枯草芽孢杆菌cre-loxp 系统的构建及整合表达菌株抗性基因的敲除  37-40
    3.3.1 载体pHY300plk-PxylR 的构建  37-38
    3.3.2 表达载体pHY300plk-PxylR-cre-trpsD 的构建  38
    3.3.3 枯草芽孢杆菌cre-loxp 系统的构建  38
    3.3.4 整合表达菌株抗性基因的敲除  38-39
    3.3.5 质粒pHY300plk-PxylR-cre-trpsD 的丢失  39-40
  3.4 整合型菌株B. subtilis W6600 (5E-pmt-loxp-3E)全细胞不对称还原反应  40-41
    3.4.1 葡萄糖浓度对整合型重组枯草芽孢杆菌全细胞生物转化的影响  40-41
    3.4.2 底物MAK 浓度对整合型重组枯草芽孢杆菌全细胞生物转化的影响  41
  3.5 游离表达菌株与整合型菌株的比较  41-44
    3.5.1 生长曲线的测定  41-42
    3.5.2 细胞回用次数的考察  42
    3.5.3 转化过程中辅酶问题的考察  42-44
主要结论与展望  44-46
致谢  46-48
参考文献  48-52
附录  52-53

重组枯草芽孢杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱的研究

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