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猪链球菌对四环素耐药机制的研究及耐药基因三重PCR检测方法的建立

作　者: 许晓燕
导　师: 崔言顺
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌药敏试验最低抑菌浓度耐药基因三重PCR
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的猪不同临床诊断类型传染病的总称。可致猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎和局部脓肿,同时该病还可导致生猪从业人员感染和死亡,是一种重要的人畜共患病。随着抗生素在国内外养猪业中的广泛应用,猪链球菌耐药性已相当严重,并呈现一定的区域特征。因此在具体治疗过程中,应了解当地菌株的耐药特点,选择敏感性药物进行治疗,才能取得良好的治疗效果。四环素作为治疗猪链球菌感染的主要有效药物,广泛用于畜牧养殖后,使得猪链球菌对其耐药性日益严重,因此,本试验通过对四环素耐药性及耐药基因的研究,力求在分子水平上为阐明猪链球菌对四环素的耐药机制提供依据。同时,通过对四环素耐药基因的三重PCR检测方法的建立,使猪链球菌对四环素耐药性的实验室快速检测成为可能。本试验主要从以下几个方面进行了研究:1.检测我国不同地区猪链球菌对常用抗生素的整体耐药情况。通过药敏试验检测了1998年—2007年自我国不同地区分离鉴定的106株猪链球菌对10种临床常用抗生素头孢吡肟、头孢曲松、红霉素、克拉霉素、四环素、万古霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、克林霉素的耐药性情况。整体上看,所测菌株对四环素有普遍的耐药性,耐药率达100 %;对于对头孢曲松、红霉素、克拉霉素、克林霉素有一定的耐药性,耐药率在15 %~20 %之间;对头孢吡肟、万古霉素和氯霉素仍保存良好的敏感性。多重耐药率为33 %,多重耐药现象主要以2耐为主(17株,16.1 %),主要耐药菌株及多重耐药的菌株集中出现在江苏、四川和重庆。本试验为掌握我国大部分地区猪链球菌的耐药性情况及临床提供有效药物治疗提供了依据。2.从分子水平上为研究猪链球菌对四环素的耐药机制提供依据。将耐药菌株对四环素的最低抑菌浓度进行测定,并对四环素耐药基因tet(M)、tet(O)、tet(K)、tet(L)、tet(Q)、tet(S)、tet(T)和tet(W)进行扩增和序列分析。试验结果表明,所测菌株99%以上均为四环素高度耐药菌株,我国大部分地区猪链球菌对四环素耐药现象严重;本试验检测的猪链球菌对四环素的耐药基因为tet(M)(80.2 %)、tet(O)(18.9 %)和tet(L)(14.2 %),表明我国的猪链球菌对四环素的耐药机制主要是由tet(M)基因介导的核糖体保护作用;同时本试验的检测结果显示,同为编码核糖体保护蛋白的tet(M)、tet(O)基因单独存在时,tet(M)基因的耐药程度高于tet(O)基因;本试验所检测的tet(M)、tet(O)基因与GenBank中我国不同地区的同种和不同种细菌的耐药基因具有高度的同源性(95 %~100 %,95 %~99 %),表明tet基因在猪源与人源及其它动物源不同种属细菌间存在广泛的交换,为猪链球菌对四环素耐药机制的研究奠定基础。3.成功建立了四环素常见耐药基因的三重PCR检测方法。通过对临床所测四环素耐药基因tet(M)、tet(O)和tet(L)的序列进行分析比对,分别在其高度保守区设计3对特异性引物,建立并优化了三重PCR检测耐药基因的方法。应用该方法检测15株猪链球菌对四环素的耐药性,并与药敏试验结果进行比较,结果表明,该方法具有敏感、特异、重复性好等优点,与药敏结果符合率达到100 %,建立了实验室快速准确检测猪链球菌对四环素耐药性的方法。

全文目录

缩略词  4-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 引言  12-29
  1.1 猪链球菌研究进展  12-18
    1.1.1 猪链球菌的血清型  12
    1.1.2 猪链球菌的毒力因子  12
    1.1.3 猪球菌流行病学特征  12-18
  1.2 兽医临床常用的四环素类  18-20
    1.2.1 土霉素（Oxytetracycline）  18-19
    1.2.2 四环素（Tetracycline）  19-20
    1.2.3 多西环素（Doxycycline）  20
  1.3 猪链球菌的耐药现状  20-21
  1.4 猪链球菌对四环素类药物耐药现状  21-23
    1.4.1 国外猪链球菌对四环素类药物耐药现状  21-22
    1.4.2 国内猪链球菌对四环素类药物耐药现状  22-23
  1.5 猪链球菌对四环素类抗生素的耐药机制  23-26
    1.5.1 外排泵蛋白（Efflux protein）  23-24
    1.5.2 核糖体保护蛋白（Ribosomal protection proteins，RPPs）  24-25
    1.5.3 耐药基因的表达和调节  25
    1.5.4 tet 基因的分布及转移  25-26
  1.6 多重PCR 技术  26-29
    1.6.1 多重PCR 的技术要素  26-27
    1.6.2 多重PCR 技术的应用  27-29
2 材料和方法  29-39
  2.1 猪链球菌耐药性的研究  29-32
    2.1.1 材料  29-31
    2.1.2 方法  31-32
      2.1.2.1 细菌培养与菌液制备  31
      2.1.2.2 药敏试验  31-32
  2.2 猪链球菌对四环素耐药机制的研究  32-35
    2.2.1 材料  32-33
    2.2.2 方法  33-35
      2.2.2.1 最低抑菌浓度(MIC)的测定  33-34
      2.2.2.2 四环素耐药基因的检测  34
      2.2.2.3 PCR 产物的纯化回收  34
      2.2.2.4 耐药基因的克隆、酶切鉴定  34
      2.2.2.5 耐药基因的测序及序列分析  34-35
  2.3 四环素耐药基因tet (M)、tet(O)、tet(L)三重PCR 检测方法的建立  35-39
    2.3.1 材料  35-36
    2.3.2 方法  36-39
      2.3.2.1 引物设计  36
      2.3.2.2 模板的制备  36
      2.3.2.3 单项PCR 扩增条件的优化  36-37
      2.3.2.4 测序分析  37
      2.3.2.5 三重PCR 扩增条件的优化  37-38
      2.3.2.6 特异性试验  38
      2.3.2.7 敏感性试验  38
      2.3.2.8 三重PCR 方法与药敏试验符合率检测  38-39
3 结果与分析  39-48
  3.1 猪链球菌耐药性的研究  39-41
    3.1.1 耐药率检测结果  39
    3.1.2 耐药率与地区统计结果  39-40
    3.1.3 多重耐药检测结果  40-41
  3.2 猪链球菌对四环素耐药机制的研究  41-43
    3.2.1 最低抑菌浓度（MIC）结果  41
    3.2.2 耐药基因检测结果  41
    3.2.3 耐药性和耐药基因的关系  41-42
    3.2.4 耐药基因序列比对和同源性分析结果  42-43
      3.2.4.1 tet(M)基因序列比对结果  42-43
      3.2.4.2 tet(O)基因序列比对结果  43
  3.3 四环素耐药基因tet (M)、tet(O)、tet(L)三重PCR 检测方法的建立  43-48
    3.3.1 单项PCR 方法的建立和产物序列分析  43-44
      3.3.1.1 单项PCR 方法的建立  43-44
      3.3.1.2 扩增产物序列分析  44
    3.3.2 三重PCR 扩增条件的确立  44-46
      3.3.2.1 最佳退火温度  44
      3.3.2.2 最佳引物浓度  44-45
      3.3.2.3 最佳dNTP 浓度  45-46
    3.3.3 三重PCR 检测的特异性  46
    3.3.4 三重PCR 检测的敏感性  46-47
    3.3.5 三重PCR 方法与药敏试验符合率检测结果  47-48
4 讨论  48-52
结论  52-53
参考文献  53-61
致谢  61-62
论文发表情况  62-63
硕士学位论文内容简介及自评  63

猪链球菌对四环素耐药机制的研究及耐药基因三重PCR检测方法的建立

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