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基于电喷雾质谱（ESI-MS）的稳定同位素标记对糖类物质进行相对定量和定性分析方法的研究

作　者: 薛向东
导　师: 黄琳娟
学　校: 西北大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 稳定同位素标记电喷雾质谱相对定量生物标志物
分类号: Q53
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蛋白质糖基化是真核细胞中最常见的翻译后修饰过程,对蛋白质生物学功能的正确发挥起着至关重要的作用。研究表明,许多疾病的发生都伴随着细胞内糖蛋白糖链结构和表达量的异常变化。可以通过检测某些糖链是否异常表达来作为细胞是否病变的标志。因此糖类物质可作为诊断某些疾病的生物标志物。本研究通过同位素标记与现代生物质谱技术结合的研究方法,对多种不同来源的糖类样品进行了相对定量和定性分析,以研究糖链在不同样品中是否表达以及表达量的差异。本研究采用两种方法对还原性糖链以及N-糖链进行了相对定量和定性的研究：1.基于电喷雾质谱(ESI-MS)和苯胺稳定同位素标记对还原性糖链进行相对定量和定性方法的研究。建立了一种基于生物质谱的苯胺稳定同位素标记,对还原性糖链进行相对定量和定性的研究方法。先用d0苯胺标记乳糖标准品,优化了影响标记效率的各种反应条件。在弱酸环境下,糖链：苯胺：硼氢氰化钠摩尔比为1：1.2：10,70℃反应15 min即可标记完全；对4对d0/d5苯胺标记的麦芽糊精糖链在电喷雾质谱中的线性、动态范围以及重现性进行了考察。结果表明,在15倍动态范围内,此相对定量方法有着很好的线性关系R=0.9986和重现性CV=10.20%。为验证所建方法的可行性,将该相对定量方法应用于人奶游离糖(HMOs)和牛奶游离糖(BMOs)分析中,发现人奶中乳糖的含量明显多于牛奶,人奶中的游离糖比牛奶中的游离糖种类复杂。2.基于电喷雾质谱和丙酮稳定同位素标记对N-糖链进行相对定量分析方法的研究。建立了一种基于电喷雾电离质谱的丙酮稳定同位素标记对N-糖链进行相对定量的研究方法。用非特异性的蛋白酶Pronase E代替传统的PNGase F酶解糖蛋白样品,使N-糖蛋白样品被酶解为带有一个氨基酸的糖氨酸(Glycans-Asn),这样就给糖链引入了一个氨基活性基团,然后用丙酮对氨基进行标记。用d0/d6丙酮对Ribo B标准品的PronaseE酶解产物M5-M8-Asn进行标记,考察了4对d0/d6丙酮标记的Glycans-Asn(M5-M8-Asn)在电喷雾电离质谱中的线性、动态范围以及重现性。结果表明,在10倍动态范围内,相对定量方法有良好的线性关系R>0.995和重现性CV<8.7%。并将建立的方法应用于不同含量鸡卵清白蛋白的N-糖链定量中,进一步验证了该方法的可行性。综上所述,本研究是基于生物质谱和稳定同位素标记建立起的相对定量和定性方法。该方法成本低,操作简单,检测灵敏,可高通量的研究生物样品中微量糖链表达量的变化,为进一步研究糖类生物标志物奠定了基础。

基于电喷雾质谱（ESI-MS）的稳定同位素标记对糖类物质进行相对定量和定性分析方法的研究

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