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表达布氏杆菌sodc基因的重组沙门氏菌的构建及不同种布氏杆菌鉴别PCR检测方法的建立

作　者: 刘新军
导　师: 何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 布氏杆菌病多重PCR 新型疫苗
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

布氏杆菌病(Brucellosis)是由布氏杆菌(Brucella)引起的一类人畜共患的急、慢性传染病。常规布氏杆菌活疫苗因其有效性及生物安全性上的缺陷,给布氏杆菌病的防制带来隐患,开发新型安全有效的疫苗迫在眉睫。新近研究表明sodc蛋白是布氏杆菌重要的毒力因子和保护性抗原,是优秀的疫苗候选抗原。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有能有效递呈抗原、细胞免疫、诱导粘膜免疫、成本低廉、副作用低等优点。本研究将抗原基因sodc克隆至无抗性原核表达质粒,成功构建能有效表达外源抗原的无抗性重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组菌菌株的免疫效果进行初步评价,为布氏杆菌病的防治进行初步探索。我国目前所采用的虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)等有较高的假阳性,酶联免疫吸附试验(ELISA)大多数局限于布氏杆菌抗体检测。PCR检测方法具有特异性好、敏感性高等优点,而且能确实诊断是否有布氏杆菌的感染,有利于病原流行病学调查和淘汰感染动物。感染人和经济动物布氏杆菌主要有羊种、牛种和猪种布氏杆菌,牛奶是布氏杆菌病的传染源之一,因此建立快速诊断牛奶的多重PCR检测方法,对人和经济动物都具有很重要的生物安全意义。主要研究内容如下：1.表达sodc的减毒沙门氏菌工程菌株的构建根据Gene-Bank中的已知序列设计引物,扩增sodc基因,然后将该片段克隆到表达质粒pYA3493中,得到重组质粒pYA-sodc。将pYAsodc和pYA3493分别电转化猪霍乱沙门氏菌C500的asd缺失株C501中,制备重组菌株C501(pYA-sodc)和空载体菌株C501(pYA3493)。SDS-PAGE鉴定和Western-blot结果表明sodc基因能够表达。研究结果表明,重组菌株C501(pYA-sodc)不仅保留了亲本菌株C500的表型特征,且能稳定遗传并分泌表达外源蛋白。将重组菌C501(pYA-sodc)分别以口服和肌肉注射途径免疫小鼠,结果显示两种免疫方法均可以诱导体液免疫反应和产生IFN-γ。2.多重PCR的构建参照David Garcia-Yoldi等(2006)建立的多重PCR,以P7-P12为引物建立的多重PCR, B.abortus, B.melitensis和B.suis都均扩增出目的片段,但该多重PCR却不能鉴别诊断这三个种。参照Bricker等(1994)建立的AMOS-PCR,设计引物P1-P6建立的PCR, B.abortus, B.melitensis和B.suis都能够扩增出种特异性的片段,该多重PCR可检测到93 pg B.melitensis 16 M的DNA；70 pg B.abortus 2308的DNA; 41 pg B.suis1330的DNA; 710 pg B.melitensis 16 M、B.abortus 2308、B.suis1330混合DNA；从牛奶中能检测到2.4×106 CFU／ml的布氏杆菌。沙门氏菌,链球菌,金黄色葡萄球菌都没有扩增出目的片段。而我们在16份牛奶样品(RBT检测阳性)的检测中,检测到一份牛奶样品为B.abortus和B.suis阳性。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词  11-12
第1章文献综述  12-27
  1 布氏杆菌病概况  12
  2 布氏杆菌分子生物学检测方法  12-15
    2.1 属特异性PCR检测  12-13
    2.2 布氏杆菌种和生物型的PCR检测  13-15
    2.3 PCR检测样品DNA提取  15
  3 布氏杆菌新型疫苗  15-27
    3.1 DNA疫苗  16-18
    3.2 重组蛋白疫苗  18-19
    3.3 活载体疫苗  19-20
    3.4 多价苗  20
    3.5 基因缺失苗  20-23
      3.5.1 BP26基因缺失突变株  21-22
      3.5.2 LPS合成相关基因基因缺失突变株  22
      3.5.3 OMP基因缺失突变株  22
      3.5.4 生长代谢及毒力相关基因缺失突变株  22-23
    3.6 胶囊疫苗  23-24
    3.7 疫苗的展望  24-27
      3.7.1 新型疫苗组分的筛选  24-25
      3.7.2 生物佐剂的使用  25
      3.7.3 基因缺失苗  25-26
      3.7.4 多价苗和CTL效应  26-27
第2章表达布氏杆菌SODC蛋白的重组沙门氏杆菌的构建  27-43
  2.1 材料  27-29
    2.1.1 菌种、质粒  27
    2.1.2 实验动物  27
    2.1.3 主要试剂和试剂盒  27-28
    2.1.4 主要培养基及试剂的配制  28-29
  2.2 实验方法  29-34
    2.2.1 Cu-Zn SOD基因克隆  29-30
    2.2.2 重组质粒pYA-sodc的构建  30-31
    2.2.3 重组沙门氏菌菌株构建  31-32
    2.2.4 重组菌株的鉴定  32
    2.2.5 重组菌株生物学特性鉴定  32-33
    2.2.6 重组菌株对小鼠的免疫试验  33-34
  2.3 结果与分析  34-40
    2.3.1 sodc基因的克隆  34
    2.3.2 重组质粒pYA-sodc的构建与鉴定  34-35
    2.3.3 重组菌株C501(pYA-sodc)的构建与鉴定  35-36
    2.3.4 重组菌株C501(pYA-sodc)的分泌表达  36
    2.3.5 重组菌株C501(pYA-sodc)的表型鉴定  36
    2.3.6 重组菌株C501(pYA-sodc)的生长特性研究  36-37
    2.3.7 重组菌株C501(pYA-sodc)的遗传稳定性  37-39
    2.3.8 重组菌株C501(pYA-sodc)对小鼠的免疫试验  39-40
  2.4 讨论  40-43
    2.4.1 活载体在布氏杆菌疫苗研究中的应用  40-41
    2.4.2 Cu/Zn-SOD  41
    2.4.3 sodc基因在C500crp-/asd-缺失株平衡致死系统中的表达  41-43
第3章鉴别牛、羊和猪3个布氏杆菌种多重PCR的建立  43-53
  3.1 材料  43-44
    3.1.1 菌种和基因组DNA  43
    3.1.2 试剂及主要试剂盒  43-44
    3.1.3 细菌培养基  44
    3.1.4 主要仪器设备  44
    3.1.5 溶液的配置  44
  3.2 方法  44-47
    3.2.1 引物的设计  44
    3.2.2 布氏杆菌的培养  44-45
    3.2.3 布氏杆菌基因组DNA的提取  45
    3.2.4 牛奶样品基因组的提取  45-46
    3.2.5 PCR扩增  46
    3.2.6 多重PCR反应条件优化  46
    3.2.7 多重PCR敏感性检测  46
    3.2.8 多重PCR特性性检测  46
    3.2.9 多重PCR检测方法的初步临床应用  46-47
  3.3 试验结果  47-50
    3.3.1 布氏杆菌的纯化培养  47
    3.3.2 多重PCR的建立  47-48
    3.3.3 多重PCR敏感性检测  48-50
    3.3.4 多重PCR特异性检测  50
    3.3.5 多重PCR检测方法的初步临床应用  50
  3.4 讨论  50-53
第4章结论  53-54
  4.1 表达布氏杆菌SODC蛋白的重组沙门氏菌的构建  53
  4.2 多重PCR的构建  53-54
参考文献  54-62
致谢  62

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