学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

ISG15的原核表达和多克隆抗体的制备及其与猪瘟病毒相互作用的初步研究

作　者: 蔡新斌
导　师: 罗廷荣
学　校: 广西大学
专　业: 预防兽医学
关键词: ISG15基因 多克隆抗体制备 猪瘟病毒 细胞系筛选 相互作用
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 44次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


猪瘟病毒是猪烈性传染病猪瘟的病原,属于黄病毒科瘟病毒属,是一种单股正链的RNA病毒,能够在感染的猪体内引起持续性感染。ISG15是一种由Ⅰ型干扰素诱导机体产生的抗病毒蛋白,研究表明ISG15对一些病毒如人免疫缺陷病毒(HIV-1)、B型流感病毒等具有抗病毒作用。本实验室使用基因芯片技术检测猪瘟病毒感染猪只的外周血单个核细胞的基因转录谱的研究中,发现猪瘟病毒感染猪后1、3、6、9天采集的外周血淋巴细胞中ISG15基因mRNA分别呈2.63、4.51、4.43、2.18倍的变化。本研究的目的是为了进一步在蛋白水平上验证感染猪瘟病毒后细胞ISG15的表达变化,并探讨在宿主细胞中ISG15与猪瘟病毒之间的相互关系,为进一步探索猪瘟病毒的持续性感染的分子机制打下基础。本研究通过重组人Ⅰ型干扰素IFNα-2b诱导PK15细胞转录干扰素刺激基因,RT-PCR方法扩增ISG15基因,并克隆至pMD18-T载体上,再将ISG15基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1与真核表达载体pCDNA3.0。重组原核表达载体pGEX-ISG15转化BL21菌株,IPTG诱导表达ISG15重组蛋白,经过Ni-NTA树脂纯化重组蛋白,将纯化的ISG15重组蛋白与弗氏佐剂乳化免疫小鼠,制备ISG15多克隆抗体。重组真核表达载体pCDNA-ISG15用脂质体介导的方法转染PK-15细胞,用新霉素类抗生素G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的PK-15细胞系。通过制备的ISG15多克隆抗体,用间接免疫荧光与Western-blot方法检测猪瘟病毒感染PK-15细胞后的0、3、6、12、24、48、60 h的ISG15蛋白表达变化,ISG15蛋白在猪瘟病毒感染的PK-15细胞中表达增加,推测是ISG15蛋白介导的对猪瘟病毒蛋白的泛素化水解途径被猪瘟病毒阻断。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章 前言  10-24
  1.1 干扰素刺激基因ISG15  10-11
  1.2 ISG15蛋白的结构  11
  1.3 ISG15的类泛素化修饰系统  11-13
  1.4 ISG15与细胞内的蛋白  13
  1.5 ISG15及其泛素化修饰系统的抗病毒作用  13-21
    1.5.1 ISG15与流感病毒  13-16
    1.5.2 ISG15与辛德毕斯病毒  16
    1.5.3 ISG15与单纯疱疹病毒  16
    1.5.4 ISG15与埃博拉病毒  16-17
    1.5.5 ISG15与乙肝病毒、水泡型口炎病毒、淋巴脉络丛脑炎病毒  17-18
    1.5.6 ISG15与丙肝病毒  18-19
    1.5.7 ISG15与日本脑炎病毒  19-20
    1.5.8 ISG15与冠状病毒  20
    1.5.9 ISG15与人免疫缺陷病毒  20-21
  1.6 猪瘟病毒对宿主细胞干扰素途径的调节作用  21-22
  1.7 本研究的目的与意义  22-24
第二章 材料与方法  24-44
  2.1 实验材料  24-28
    2.1.1 主要仪器与设备  24
    2.1.2 实验动物  24
    2.1.3 实验试剂  24-28
  2.2 实验方法  28-44
    2.2.1 技术路线  28
    2.2.2 引物设计  28
    2.2.3 ISG15基因的克隆  28-32
    2.2.4 ISG15原核与真核表达载体的构建  32-34
    2.2.5 ISG15多克隆抗体的制备  34-40
    2.2.6 ISG15稳定表达细胞系的构建  40-43
    2.2.7 感染CSFV的PK-15细胞ISG15的表达状况  43-44
第三章 结果与分析  44-58
  3.1 ISG15基因的克隆  44-45
  3.2 ISG15基因原核与真核表达载体的构建  45-46
  3.3 ISG15多克隆抗体的制备  46-52
    3.3.1 原核表达载体pGEX-ISG15的表达  46-47
    3.3.2 ISG15重组蛋白表达形式的鉴定  47
    3.3.3 ISG15重组蛋白的Ni-NTA树脂亲和纯化  47-48
    3.3.4 纯化的ISG15重组蛋白的鉴定  48-49
    3.3.5 免疫后的多克隆血清与重组ISG15蛋白的反应性  49-51
    3.3.6 ISG15多克隆抗体与PK-15细胞中ISG15蛋白的反应性  51-52
  3.4 ISG15稳定表达细胞系的构建  52-55
    3.4.1 ISG15真核表达载体转染PK-15细胞  52-53
    3.4.2 IFA鉴定ISG15稳定表达的PK-15细胞系  53-54
    3.4.3 Western-blot鉴定ISG15稳定表达的PK-15细胞系  54-55
  3.5 CSFV与ISG15相互作用的初步探索  55-58
    3.5.1 间接免疫荧光检测PK-15细胞感染CSFV病毒后ISG15的表达状况  55-56
    3.5.2 Western-blot检测PK-15细胞感染CSFV病毒后ISG15的表达状况  56-58
第四章 讨论  58-63
  4.1 ISG15原核表达的策略  58
  4.2 重组蛋白的纯化  58-60
  4.3 多克隆抗体的效价  60
  4.4 稳定表达ISG15蛋白的PK-15细胞系的构建  60
  4.5 CSFV感染PK-15细胞后ISG15表达  60-63
第五章 结论  63-64
参考文献  64-71
攻读硕士学位期间发表的论文  71-72
致谢  72

相似论文

  1. 环氧分子在碳纤维表面相互作用的分子模拟研究,TB332
  2. 棉花纤维初始发育期14-3-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,S562
  3. 酸模根际产铁载体矿物分解细菌的分离筛选及其与矿物相互作用,Q93-33
  4. 不同类型亲水性结构表面修饰的聚氨酯材料与凝血十二因子九肽片段及纤维蛋白原P1片段相互作用的计算机模拟,O631.3
  5. 猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究,S858.28
  6. 白斑综合征病毒（WSSV）重复单元ORF94的序列差异分析及囊膜蛋白的相互作用,S945.1
  7. 免疫共沉淀联合质谱筛选肝核因子HNF3β相互作用蛋白质及初步功能研究,R341
  8. 核蛋白NDP52与肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6相互作用及临床意义的研究,R363
  9. 卷曲螺旋蛋白52与TRAF6及其家族成员相互作用对NF-κB通路的影响研究,R363
  10. 抗重金属汞、铜、锌单抗可变区序列的克隆鉴定、真核表达及三维模拟,X171.5
  11. IHHN、TS的流行病学调查和TSV结构蛋白VP1、VP3相互作用的研究,S945
  12. 关于非线性偏微分方程精确解的若干研究,O175.29
  13. 烷基甜菜碱复合体系溶液性质的研究,TQ423.3
  14. 倾斜载荷作用下导管架平台桩基承载力分析,P75
  15. 地震灾害下跨接管结构的响应分析,P756.2
  16. 大鼠胸主动脉平滑肌细胞内PARP-1在VDR转录调节中作用的研究,R541
  17. 储油罐平台动力模型试验研究,TE972
  18. 湖羊ISG15基因的单核苷酸多态性分析及诱导表达,S826
  19. 猪瘟病毒E~（rns）蛋白在毕赤酵母中的表达及其单克隆抗体制备,S852.65
  20. AUTOPIPE在立管系统建模分析中的应用研究,TE952

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学 > 猪瘟病毒
© 2012 www.xueweilunwen.com