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缝隙连接通道改变参与脑血管痉挛的实验研究

作　者: 叶新运
导　师: 洪涛
学　校: 南昌大学
专　业: 外科学
关键词: 蛛网膜下腔出血同型缝隙连接异型缝隙连接脑血管痉挛重构
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:缝隙连接(gap junction GJ)广泛分存于心脑血管系统,缝隙连接通道功能的变化在许多心脑血管疾病中扮演重要角色。本实验在前期研究的基础上,应用免疫共沉淀技术研究蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管缝隙连接通道类型的变化,为更深入研究脑血管GJ通道参与SAH后CVS的机制奠定基础,可能为更有效防治CVS寻找一个崭新的途径。方法:1.建立兔二次SAH后CVS模型:新西兰大白兔3%戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉后,枕大池穿刺注射未肝素化新鲜自体动脉血(0.5ml/kg),清醒后正常喂养,24h后二次重复注血。2.动物CVS模型的检测:分为假注血组及SAH组,在建立模型前及建立模型后的7d行两次DSA造影,比较各实验组基底动脉直径的变化;二次造影后,经心脏行全脑灌注固定作HE染色,光镜下观察血管壁组织形态学的变化。3. GJ蛋白表达类型的变化:各组动物在行DSA造影后处死取脑,分离基底动脉,应用免疫共沉淀技术分别以Cx43、Cx45、Cx40、Cx3为抗体沉淀提纯相应蛋白, Western Blot技术分别检测基底动脉Cx43、Cx45、Cx40、Cx37与基它三种蛋白表达相互作用的变化,推测这些缝隙连接蛋白组成同型通道或异常通道的变化。结果:1.成功建立兔二次SAH后CVS模型:DSA造影显示正常对照组造模前后基底动脉直径比值为97.2%±1.5%,SAH-7d组造模前后基底动脉直径比值为63.7%±7.1%,与对照组相比具有显著差异性(p﹤0.05)。光镜下可见痉挛的血管管腔狭窄和管壁增厚;内皮细胞部分坏死脱落致内弹力层裸露,胞质中见有空泡形成,部分细胞胞核浓染固缩;内弹力层呈波纹状卷曲、断裂;平滑肌细胞肥大、变性并伴有坏死。2.以Cx43为沉淀蛋白得出SAH组Cx43、Cx45、Cx37表达较假注血组明显增加,而SAH组Cx40表达较假注血组明显减少;相似地,以Cx45为沉淀蛋白可以得出SAH组Cx45、Cx43、Cx37表达较假注血组明显增加,而SAH组Cx40表达较假注血组明显减少;以Cx40为沉淀蛋白得出SAH组Cx43、Cx45、Cx37、Cx40表达较假注血组均明显减少;以Cx37为沉淀蛋白得出SAH组Cx43、Cx45、Cx37表达较假注血组明显增加,而SAH组Cx40表达较假注血组明显减少。3. Cx43与Cx43、Cx45与Cx45、Cx37与Cx37形成的同型缝隙连接通道在SAH后较正常组增加。Cx40与Cx40形成的同型缝隙连接通道在SAH后较正常组减少。Cx37与Cx45、Cx37与Cx43、Cx45与Cx43形成的异型缝隙连接通道在SAH后较正常组增加。Cx37与Cx40、Cx40与Cx43、Cx40与Cx45形成的异型缝隙连接通道在SAH后较正常组减少。结论:在CVS过程中,多种GJ蛋白(Cx37、Cx40、Cx43、Cx45)的相互作用程度发生了不同的变化,相应地形成各种同型缝隙连接通道或异型缝隙连接通道数量的变化,表明GJ通道的改变可能参与了SAH后CVS的发生。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第1章引言  11-13
第2章材料与仪器  13-18
  2.1 实验动物  13
  2.2 实验试剂  13-16
    2.2.1 主要购置试剂  13-14
    2.2.2 主要配置试剂  14-16
  2.3 实验仪器  16-18
第3章实验方法  18-26
  3.1 实验分组  18
  3.2 兔体内二次蛛网膜下腔出血CVS 模型的建立  18
  3.3 选择性脑基底动脉造影及血管直径的测量  18-19
  3.4 HE 染色观察组织形态学的变化  19-20
    3.4.1 组织制备及HE 染色  19-20
    3.4.2 显微镜观察  20
  3.5 免疫共沉淀  20-21
    3.5.1 制备组织裂解物  20
    3.5.2 预纯化裂解物  20-21
    3.5.3 免疫沉淀  21
  3.6 Western blotting 技术检测Cx37 、Cx40、Cx43、Cx45 蛋白共沉淀后Cx37、Cx40、Cx43、Cx45 相互作用表达的变化  21-25
    3.6.1 总蛋白样品制备  21
    3.6.2 样品蛋白含量的测定  21-22
    3.6.3 配制5%积层胶及8%分离  22
    3.6.4 灌胶及上样  22
    3.6.5 垂直电泳  22-23
    3.6.6 转膜  23
    3.6.7 目标蛋白免疫反应  23-24
    3.6.8 目标蛋白化学发光及曝光  24
    3.6.9 膜再生  24
    3.6.10 其余三种缝隙连接蛋白及内参蛋白免疫反应  24-25
    3.6.11 其余三种缝隙连接蛋白及内参蛋白化学发光及曝光  25
    3.6.12 图像分析  25
  3.7 数据统计分析  25-26
第4章实验结果  26-31
  4.1 CVS 模型的成功建立  26
    4.1.1 形态学观察  26
    4.1.2 脑血管造影  26
  4.2 Cx43 免疫共沉淀后Cx43、Cx37、Cx40、Cx45 蛋白表达的变化  26-27
  4.3 Cx45 免疫共沉淀后Cx43、Cx37、Cx40、Cx45 蛋白表达的变化  27-28
  4.4 Cx40 免疫共沉淀后 Cx40、Cx37、Cx43、Cx45 蛋白表达的变化  28-29
  4.5 Cx37 免疫共沉淀后 Cx37、Cx40、Cx43、Cx45 蛋白表达的变化  29-31
第5章讨论  31-37
  5.1 SAH 后CVS 的研究现状  31-32
  5.2 缝隙连接  32
  5.3 GJ 通道类型及功能变化的相关研究  32-33
  5.4 GJ 通道类型变化在CVS 的作用机制探讨  33-35
  5.5 展望  35-37
第6章结论  37-38
致谢  38-39
参考文献  39-43
附图  43-50
攻读学位期间的研究成果  50-51
附带综述  51-57

缝隙连接通道改变参与脑血管痉挛的实验研究

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