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可溶性hPPARγ-LBD重组蛋白的制备及功能表征

作　者: 段雯
导　师: 余瑜
学　校: 重庆医科大学
专　业: 药物化学
关键词: 靶点蛋白 hPPARγ-LBD 重组蛋白表达分子排阻色谱-高效液相色谱法
分类号: R979.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 29次
引　用: 1次
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内容摘要

癌症是人类最难攻克的顽症之一。目前临床上的抗肿瘤药物均存在毒性大、选择性差等问题,为此,开发高效低毒的抗肿瘤药物具有十分重要的意义。近年来,国内外针对抗肿瘤药物的研究正从传统的细胞毒性抗肿瘤药物转向针对肿瘤信号转导途径中多环节作用靶点的抗肿瘤药物,其中的热点之一就是以脂代谢信号传导途径中关键靶点蛋白PPARγ亚型(peroxisome proliferater-activated receptorγ, PPARγ)作为药物靶点的抗肿瘤药物研究,此类药物研究的难点在于获取大量高纯度、具有生物学功能的靶点重组蛋白。为此,本文采用六聚组氨酸(His6)为标签,构建了pReceiver-B01-hPPARγ-LBD表达载体,通过表达纯化得到可溶性的hPPARγ-LBD(human peroxisome proliferater-activated receptorγligand binding domain, hPPARγ-LBD)重组蛋白,有利于进一步研究其结构和功能;并采用分子排阻色谱-高效液相色谱法(size exculsion chromatography - high performance liquid chromatography, SEC-HPLC)对hPPARγ-LBD重组蛋白与配体药物的结合活性进行了研究,为以hPPARγ-LBD重组蛋白为靶点蛋白的药物设计及筛选奠定了基础。本文完成的主要工作和结论如下:1.制备了hPPARγ-LBD重组蛋白。经SDS-PAGE分析,该重组蛋白的分子量约为32 kDa,与理论分子量一致。2.优化了hPPARγ-LBD重组蛋白的表达条件。在优化条件(16℃,0.6 mmol/L IPTG,诱导20 h)下,能表达可溶性的hPPARγ-LBD重组蛋白。3.优化了hPPARγ-LBD重组蛋白的纯化条件。经镍亲和色谱纯化后,以每升LB培养基计可获得41 mg、纯度为95%的hPPARγ-LBD重组蛋白。4.建立了分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC),考察了hPPARγ-LBD重组蛋白与配体药物结合的活性。该重组蛋白能与罗格列酮特异性结合,其结合率达到65%。综上所述,本文成功制备了具有生物学活性的可溶性hPPARγ-LBD重组蛋白,基于脂代谢靶点蛋白hPPARγ-LBD建立了快速、稳定及准确性高的抗肿瘤药物体外筛选模型方法,为抗肿瘤新药的设计和筛选奠定了基础。

全文目录

符号说明  5-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-15
第一部分可溶性hPPARγ-LBD 重组蛋白的表达  15-27
  1 实验材料  15-20
  2 方法和结果  20-25
  3 讨论  25-26
  4 小结  26-27
第二部分 hPPARγ-LBD 重组蛋白的纯化  27-34
  1 实验材料  27-28
  2 方法和结果  28-33
  3 讨论  33
  4 小结  33-34
第三部分 hPPARγ-LBD 重组蛋白的体外生物学活性研究  34-52
  1 实验材料  35-36
  2 方法和结果  36-50
  3 讨论  50-51
  4 小结  51-52
全文总结  52-53
参考文献  53-56
文献综述  56-60
致谢  60-61
攻读硕士学位期间发表的论文  61

可溶性hPPARγ-LBD重组蛋白的制备及功能表征

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