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仿生纳米纤维HAp/CTS对间充质干细胞的成骨分化作用研究

作　者: 彭红菊
导　师: 张彦中
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 干细胞分化羟基磷灰石壳聚糖静电纺骨组织工程
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

用可降解的生物材料支架复合细胞,在适当的条件下构建和修复缺损骨组织是目前组织工程再生医学的研究热点之一。间充质干细胞(MSCs)是存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞,它具有容易分离,易扩增,可向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等多向分化,且免疫原性较弱等优点,是组织工程中广泛使用的干细胞类型。但是,如何在体内、体外环境下诱导形成特异组织细胞仍是一个关键。考虑到天然条件下正是干细胞赖以生存的微环境(niche)直接调控着细胞的各种行为,如何设计和研发出能精确仿生干细胞生存微环境的生物材料支架来诱导干细胞的分化,将是在本质上实现有效调控干细胞行为的一个重要研究和努力方向。天然骨的组成和结构在纳米尺度上是基于羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAp)和胶原的复合材料纳米纤维结构。基于这一认识,过去几年中,采用电纺丝(electrospinning)方法制备无机-有机混杂的复合材料纳米纤维支架,从而仿生天然骨的超微结构已在骨组织工程研究中受到愈来愈多的关注。许多研究结果表明,仿生复合材料纳米纤维支架对干细胞的分化和调控有良好的促进作用。壳聚糖(chitosan, CTS)是一种天然生物大分子材料,壳聚糖的众多优点使其已成为一种常用的骨组织工程支架构建的基体材料。尽管前期已有研究表明,电纺羟基磷灰石/壳聚糖(HAp/CTS)复合材料纳米纤维具有明显的刺激成骨体细胞的增殖和生物矿化作用,探究仿生HAp/CTS复合纳米纤维对干细胞的成骨分化潜能的研究工作则还未见报道。为此,本论文的主要目的是通过合成和制备HAp/CTS仿生复合材料纳米纤维,研究其在加成骨诱导剂和不加成骨诱导剂两种情况下对间充质干细胞的诱导分化作用和功效。本文首先用原位共沉淀的方法合成了羟基磷灰石在壳聚糖基体中占有不同比例的HAp/CTS纳米复合材料。扫描电镜(SEM)形貌观察显示,HAp纳米颗粒在CTS中分散均匀；傅立叶变换红外线光谱(FTIR)分析表明两种成分之间存在分子间相互作用；X-射线衍射法(XRD)分析了材料的结晶结构,复合物中出现两种物质特征峰,并且随着HAp含量的减少,HAp的特征峰逐渐减弱,进一步提示了羟基磷灰石和壳聚糖之间的相互作用；热重分析(TG)结果显示,与纯的壳聚糖比较,HAp/CTS复合材料的热稳定性提高约30℃,但随着壳聚糖含量增多,热损失质量增大。接着用静电纺的方法将羟基磷灰石占有不同比例的HAp/CTS复合材料制备成了相应的纳米纤维。通过大量的前期试验摸索,发现当不同质量比的HAp/CTS复合材料和纯的CTS中加15%的超高分子量聚环氧乙烷(PEO)后,在湿度为22-25%的条件下,能纺出直径非常均匀、不带珠子的形貌很好的纳米纤维。用扫描电镜(SEM)和场发射扫描电镜(FESEM)分析了电纺法制备的相应纳米纤维的形貌。红外光谱(FTIR)和X-射线衍射(XRD)分析都表明HAp/CTS复合材料在电纺成纳米纤维后两物质间仍存在相互作用。热重分析(TG)的结果显示,与纯的壳聚糖纳米纤维比较,复合材料纳米纤维的热稳定性也提高了30。C。最后,采用小鼠多潜能干细胞系C3H10T1/2,我们研究了HAp/CTS (30:70, w/w)仿生复合纳米纤维对mMSCs向成骨细胞分化的影响。细胞的SEM和增殖实验分别表明,细胞在仿生HAp/CTS复合材料纳米纤维支架上比在CTS纳米纤维支架上有更好的黏附、铺展和增殖能力。在不加任何诱导剂的情况下,基因水平骨相关基因(ColⅠ, Runx2, ALP和OCN)的检测和蛋白质水平标志蛋白碱性磷酸酶(ALP)和胶原的检测都一致性地证明,仿生HAp/CTS复合材料纳米纤维支架可显著地促进mMSCs的成骨分化能力。而加诱导剂的实验研究发现,该仿生复合材料纳米纤维支架能与常用的成骨诱导剂共效促进mMSCs的成骨分化。总之,我们当前的研究结果表明,仿生HAp/CTS复合材料纳米纤维支架能明显地促进C3H10T1/2干细胞的粘附、增殖和分化,这为今后进一步探究其在动物体内的成骨和修复缺损的功效提供了有力的数据支持。结合基于该材料的前期研究结果,有理由相信,仿生HAp/CTS复合材料纳米纤维支架将是一种很有潜力的骨组织工程构建和修复用支架材料,值得进一步研究。

仿生纳米纤维HAp/CTS对间充质干细胞的成骨分化作用研究

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