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宾赛克嗪对胆碱受体功能的拮抗作用及其对胆碱酯酶抑制剂抗毒效应的药理学特征

作　者: 潘志远
导　师: 龙超良；汪海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 胆碱酯酶抑制剂有机磷农药中毒乙酰胆碱 M受体 N受体肠黏膜屏障 D-乳酸二胺氧化酶宾赛克嗪阿托品
分类号: R595.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

胆碱酯酶抑制剂(ChEI)主要包括神经性毒剂和有机磷农药。ChEI中毒的主要机制是抑制胆碱酯酶活性,导致体内乙酰胆碱(ACh)过度蓄积,持续激活胆碱受体,引发胆碱能危象。在中枢神经系统表现为焦虑、失眠、混乱、震颤、惊厥、心血管呼吸中枢麻痹、昏迷等症状。在外周,一方面ACh激动外周自主神经系统M受体引起瞳孔缩小、腺体分泌亢进、血压下降、心动过缓、恶心、呕吐、支气管痉挛、腹痛、腹泻、大小便失禁等M样毒性症状;另一方面ACh激活外周神经节N受体后引起受体失敏,产生肌颤、无力、呼吸困难、麻痹等N样毒性症状。ChEI中毒救治是急救医学面临的重大课题。目前WHO推荐的标准救治方案是以M受体拮抗剂阿托品和胆碱酯酶复活剂为核心的综合治疗。但是采用标准方案救治急性有机磷农药中毒(AOPP)的患者,抢救失败率仍然在20%以上,死亡率居高不下。这一方案的局限性至少表现为以下三方面:(1)胆碱酯酶复活剂的使用效果仍然备受争议;(2)虽然阿托品可降低M样毒性反应,但是阿托品的组织选择性差,对M受体的亚型选择性不强,毒副作用多,易导致阿托品中毒而加重死亡率;(3)救治策略中缺少针对N受体这一重要靶点的药物。进一步研究发现N受体拮抗剂不仅能在中毒早期对抗N受体激动所介导的N样毒性反应,而且能在中毒晚期对抗失敏态N受体对M受体的易化作用,显著增强M受体拮抗剂的抗毒疗效。因此,开发具有抗M和N作用的高效抗毒剂,是提高中毒救治成功率的一条可行的现实途径。目前已公认肠黏膜屏障功能的破坏可迅速引发内毒素血症和脓毒血症,引起全身炎症反应综合征(SIRS),是诱发多器官功能障碍综合征的始动因素和核心环节。肠黏膜屏障功能的好坏对危重疾病的发生、发展和转归起着极为重要的作用。ChEI中毒发生快、起病急、程度重,是病理生理机制十分复杂的一种急危重症。临床观察到重度AOPP患者病死率高的另一个重要原因是患者发生了多器官功能障碍综合征(MODS)甚至多系统器官功能衰竭(MSOF)。因此,研究中毒状态下肠黏膜屏障功能的变化,对于阐明胆碱酯酶抑制剂中毒引起MODS的机制,开发既可有效抗毒,又可保护肠屏障功能的抗胆碱能药物具有重要价值。宾赛克嗪是具有抗M和抗N作用的新型抗毒剂。前期研究证明宾赛克嗪具有独特的治疗学优势:吸收快,易于透过血脑屏障,主要分布在肺、腺体、脑、心脏;对神经元不同亚型N受体均具有不同的可逆性的抑制作用;对五种不同亚型M受体(M1~M5)和不同的离体组织具有不同的亲和力;在沙林、梭曼、塔崩、VX中毒小鼠中抗毒效价和效能均显著强于阿托品;对神经毒战剂和有机磷农药中毒诱发的循环衰竭具有高效、速效、特效的救治作用;对毒剂诱发的呼吸衰竭具有良好的救治作用。更有意义的是,宾赛克嗪能抑制VX中毒小鼠血浆内毒素水平的增高。由于宾赛克嗪本身对肠道平滑肌和肠黏膜M受体的亲和力很低,而且用量比阿托品少,因此推断其不易引起肠麻痹等副作用,不会加重肠黏膜损伤。本论文第一部分以槟榔碱诱发中枢性震颤和外周流涎、毛果芸香碱诱发外周流涎、乙酰胆碱和氧化震颤素诱发豚鼠离体回肠收缩为评价中枢和外周M受体功能的指标,以烟碱诱发惊厥、诱发豚鼠离体回肠收缩为评价中枢和外周N受体功能的指标,以毛果芸香碱与烟碱合用同时激动M和N受体诱发混合性震颤为指标,系统地研究了宾赛克嗪拮抗胆碱能受体功能的药理学特点,并与经典抗毒剂阿托品作比较。论文第二部分研究了宾赛克嗪对胆碱酯酶活性的影响。论文第三部分研究了宾赛克嗪抗胆碱酯酶抑制剂中毒的药理学特征。在胆碱酯酶抑制剂敌敌畏染毒的小鼠模型上验证了宾赛克嗪的强效抗毒作用,并且着重研究了胆碱酯酶抑制剂中毒时肠黏膜屏障功能的改变和形态结构的变化以及宾赛克嗪的救治效果。48只雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组、VX染毒模型组、宾赛克嗪1、3、9mg/kg救治组和阿托品9mg/kg救治组;皮下注射VX(13μg/kg)染毒,药物救治组在染毒后5min腹腔注射给予相应剂量的药物,对照组给予生理盐水。于染毒后3h各组动物取血,检测血浆二胺氧化酶(DAO)活性及D-乳酸浓度,同时取小肠组织,观察肠黏膜形态和超微结构变化。结果如下:1.宾赛克嗪对胆碱受体功能拮抗作用的药理学特征1.1宾赛克嗪对中枢M受体功能的拮抗作用宾赛克嗪和阿托品抗槟榔碱(8mg/kg, sc)致小鼠中枢性震颤的ED50±LD95分别是0.31±0.06mg/kg和1.33±0.17mg/kg,宾赛克嗪对抗中枢M受体功能的作用比阿托品强3.3倍。1.2宾赛克嗪对外周M受体功能的拮抗作用宾赛克嗪和阿托品对抗槟榔碱(8mg/kg, sc)诱发小鼠外周流涎ED50值分别为0.38±0.09mg/kg和0.17±0.03mg/kg,其对抗强度比阿托品弱1.2倍。宾赛克嗪和阿托品对抗毛果芸香碱诱发小鼠外周流涎的ED50值分别为5.57±1.30mg/kg和0.46±0.18mg/kg;其对抗强度比阿托品弱11倍。宾赛克嗪和阿托品均可剂量依赖性地对抗乙酰胆碱、氧化震颤素诱发的离体回肠收缩,宾赛克嗪的作用稍弱,但两药IC50均没有显著性差异。可见,宾赛克嗪对抗外周M受体功能的作用比阿托品弱。1.3宾赛克嗪对中枢N受体功能的拮抗作用宾赛克嗪可剂量依赖性地对抗烟碱诱发的惊厥,ED50值为2.87±0.76 mg/kg。而阿托品给药20mg/kg时不能对抗烟碱诱发的惊厥,其剂量高达60mg/kg时抗惊厥率仍然<20%。1.4宾赛克嗪对外周N受体功能的拮抗作用宾赛克嗪拮抗烟碱诱发的离体回肠收缩的IC50为1.1±0.18μM,阿托品的IC50为13.84±1.68μM,两药的IC50有显著性差异(P<0.05)。宾赛克嗪比阿托品的作用强约13倍。阿托品在大于75μM时可以完全抑制烟碱诱发回肠收缩,可能与其高浓度时使肠平滑肌麻痹有关。结果提示宾赛克嗪具有明确的拮抗外周神经节N受体作用。1.5宾赛克嗪对烟碱和毛果芸香碱诱发小鼠混合性震颤的拮抗作用宾赛克嗪和阿托品对抗毛果芸香碱和烟碱诱发小鼠混合性震颤的的ED50值分别为2.64±0.35mg/kg和4.95±0.65mg/kg,比阿托品强约1倍。2.宾赛克嗪对胆碱酯酶活性的影响宾赛克嗪各浓度组对大鼠血浆和脑匀浆胆碱酯酶活性均没有影响。3.宾赛克嗪对胆碱酯酶抑制剂抗毒效应的药理学特征3.1宾赛克嗪对敌敌畏致死作用的影响宾赛克嗪和阿托品(10mg/kg)预防给药分别可以使敌敌畏的LD50±L95提高到199.40±16.02mg/kg和20.22±3.07mg/kg,宾赛克嗪抗毒的PR值提高了16.84倍,而阿托品仅提高了0.81倍。宾赛克嗪对抗敌敌畏1.2LD中毒致死作用,其ED50为2.87±0.40mg/kg。而阿托品的ED50为6.78±3.92mg/kg,宾赛克嗪的抗毒作用显著强于阿托品。3.2宾赛克嗪对维埃克斯所致肠黏膜屏障损伤的保护作用3.2.1染毒大鼠血浆D-乳酸含量的变化以及宾赛克嗪的救治作用与正常对照组(29.07±6.55μg/mL)比较,模型组血浆D-乳酸浓度明显升高(87.75±22.91μg/mL,P<0.01),较正常对照组升高了2倍。宾赛克嗪1、3、9mg/kg治疗组(64.23±24.88,56.94±10.37,45.29±11.14μg/mL)能剂量依赖性降低VX染毒大鼠血中D-乳酸含量,与模型组比较,宾赛克嗪3和9mg/kg治疗组血浆D-乳酸浓度明显降低(P均<0.01)。阿托品9mg/kg治疗组(44.42±14.38μg/mL)也可显著降低D-乳酸浓度,与宾赛克嗪等剂量组相比无差异。3.2.2染毒大鼠血浆二胺氧化酶活性的变化以及宾赛克嗪的救治作用与正常对照组(2.99±0.43 U/L)比较,模型组在染毒后3h血浆二胺氧化酶活性显著升高(P<0.01),较正常对照组升高了2.2倍。与模型组(6.72±0.93 U/L)比较,宾赛克嗪1、3、9mg/kg救治组(5.26±0.81,4.11±1.11,3.17±0.68 U/L)可剂量依赖性逆转VX染毒大鼠血浆二胺氧化酶的活性升高(P<0.05和P<0.01),宾赛克嗪9mg/kg治疗组效果最好。阿托品9mg/kg治疗组(3.24±0.50 U/L)也可显著降低二胺氧化酶活性,与宾赛克嗪等剂量组相比无差异。3.2.3染毒大鼠肠黏膜形态结构的变化以及宾赛克嗪的救治作用光镜下显示模型组大鼠小肠发生肠壁变薄,皱壁变短,结构紊乱,固有层毛细血管扩张充血,黏膜间质水肿等病理变化;电镜下显示模型组染毒大鼠小肠上皮细胞发生坏死,细胞器损伤,紧密连接破坏等变化。宾赛克嗪1、3、9 mg/kg组呈现剂量依赖性改善小肠的病理变化,阿托品9 mg/kg组也能改善此病理变化。综上所述,本研究结论如下:(1)宾赛克嗪对中枢和外周的胆碱受体均具有拮抗作用。宾赛克嗪对外周M受体功能的拮抗作用比阿托品弱,是其副作用少的基础;对中枢M受体功能的拮抗作用比阿托品强,与其易进入中枢相关;宾赛克嗪同时具有中枢和外周神经节N受体拮抗作用;因此,宾赛克嗪能够全面对抗M/N毒性效应。(2)宾赛克嗪抗ChEI中毒的抗毒效价比阿托品高一个数量级,其高效抗毒作用与其兼具有抗M和抗N作用密切相关,而与胆碱酯酶活性无关。(3)ChEI中毒时肠黏膜上皮细胞损伤,肠黏膜屏障功能破坏,通透性增加;宾赛克嗪能改善肠黏膜屏障形态结构和功能的损伤。宾赛克嗪既能高效对抗ChEI中毒的毒性症状,又能改善肠黏膜屏障损伤,这对于防止ChEI中毒诱发的MODS具有重要意义。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-16
前言  16-20
材料与方法  20-27
  一、实验材料  20-21
  二、实验方法  21-26
    2.1 宾赛克嗪对胆碱受体功能拮抗作用的药理学特征研究方法  21-23
      2.1.1 抗槟榔碱诱发小鼠中枢性震颤和外周流涎实验  21
      2.1.2 抗毛果芸香碱诱发小鼠外周流涎实验  21
      2.1.3 抗烟碱诱发小鼠惊厥实验  21-22
      2.1.4 抗烟碱和毛果芸香碱合用诱发小鼠混合性震颤实验  22
      2.1.5 抗胆碱能受体激动剂诱发离体豚鼠回肠收缩实验  22-23
    2.2 微量 DTNB 法测定胆碱酯酶活性  23
      (1) 血浆和脑匀浆制备  23
      (2) 酶活性测定操作方法  23
    2.3 宾赛克嗪对胆碱酯酶抑制剂抗毒效应的药理学特征研究方法  23-26
      2.3.1 抗敌敌畏中毒致死实验  23-24
        (1) 宾赛克嗪和阿托品对抗敌敌畏致死效应 PR 值的研究  23-24
        (2) 宾赛克嗪和阿托品对抗敌敌畏致死作用的研究  24
      2.3.2 宾赛克嗪对胆碱酯酶抑制剂所致肠黏膜屏障损伤的保护作用研究方法  24-26
        (1) 动物分组及给药方法  24-25
        (2) 血浆二胺氧化酶活性测定  25
        (3) 血浆 D-乳酸含量测定  25
        (4) 肠组织形态结构观察  25-26
        (5) 肠黏膜上皮细胞超微结构观察  26
  三、数据分析与统计处理  26-27
实验结果  27-47
  第一部分宾赛克嗪对胆碱受体功能拮抗作用的药理学特征  27-36
    1.1 宾赛克嗪对中枢 M 受体功能的拮抗作用  27-28
      1.1.1 抗槟榔碱诱发小鼠中枢性震颤作用  27-28
    1.2 宾赛克嗪对外周 M 受体功能的拮抗作用  28-31
      1.2.1 抗槟榔碱诱发小鼠外周流涎作用  28-29
      1.2.2 抗毛果芸香碱诱发小鼠外周流涎作用  29-30
      1.2.3 抗乙酰胆碱诱发离体回肠收缩作用  30-31
      1.2.4 抗氧化震颤素诱发离体回肠收缩作用  31
    1.3 宾赛克嗪对中枢 N 受体功能的拮抗作用  31-32
      1.3.1 抗烟碱诱发小鼠惊厥的作用  31-32
    1.4 宾赛克嗪对外周 N 受体功能的拮抗作用  32-33
      抗烟碱诱发离体回肠收缩作用  32-33
    1.5 宾赛克嗪对烟碱和毛果芸香碱合用诱发混合性震颤的拮抗作用  33-35
    结语  35-36
  第二部分宾赛克嗪对胆碱酯酶活性的影响  36-38
    2.1 宾赛克嗪在体外对大鼠血浆胆碱酯酶活性的影响  36
    2.2 宾赛克嗪在体外对大鼠脑匀浆乙酰胆碱酯酶活性的影响  36-37
    结语  37-38
  第三部分宾赛克嗪对胆碱酯酶抑制剂抗毒效应的药理学特征  38-47
    3.1 抗敌敌畏中毒小鼠致死作用的比较  38-41
    3.2 宾赛克嗪对维埃克斯所致肠黏膜损伤的保护作用研究  41-46
      3.2.1 VX 染毒后大鼠肠屏障功能和通透性的变化及宾赛克嗪的救治作用  41-42
        (1) 中毒 3h 后大鼠血浆 D-乳酸含量的变化以及宾赛克嗪的救治作用  41
        (2) 中毒 3h 后大鼠血浆二胺氧化酶活性的变化以及宾赛克嗪的救治作用  41-42
      3.2.2 VX 染毒后大鼠肠黏膜形态结构的变化及宾赛克嗪的救治作用  42-46
        (1) 中毒大鼠空肠黏膜形态结构的变化以及宾赛克嗪的救治作用  42
        (2) 中毒大鼠回肠黏膜形态结构的变化以及宾赛克嗪的救治作用  42-44
        (3) 中毒大鼠回肠黏膜上皮细胞超微结构的变化以及宾赛克嗪的救治作用  44
        (4) 中毒大鼠回肠黏膜上皮细胞间紧密连接的变化以及宾赛克嗪的改善作用  44-46
    结语  46-47
讨论  47-53
  一、宾赛克嗪对胆碱受体功能拮抗作用的药理学特征分析  47-49
    1. 宾赛克嗪对中枢神经系统胆碱受体功能的拮抗作用特点  47-48
    2. 宾赛克嗪对外周胆碱受体功能拮抗作用的特点  48-49
    3.宾赛克嗪对 M/N 受体激动剂合用引起的胆碱能功能亢进的拮抗作用特点  49
  二、宾赛克嗪和阿托品抗胆碱酯酶抑制剂中毒致死作用的比较  49-50
  三、宾赛克嗪对胆碱酯酶抑制剂中毒时肠黏膜屏障功能损伤的保护作用  50-53
    1. 肠黏膜屏障功能在 ChEI 中毒诱发多器官功能障碍综合征中的重要性  50-51
    2. 胆碱酯酶抑制剂中毒时肠黏膜屏障的变化特点  51-52
    3. 宾赛克嗪改善胆碱酯酶抑制剂中毒所致肠黏膜屏障功能损伤的机制分析  52-53
全文总结  53-54
参考文献  54-58
综述  58-67
个人简历  67-69
致谢  69

宾赛克嗪对胆碱受体功能的拮抗作用及其对胆碱酯酶抑制剂抗毒效应的药理学特征

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