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根癌农杆菌介导深绿木霉（Trichoderma atroviride）T23转化体系的建立以及高效降解敌敌畏突变株筛选与应用研究

作　者: 孙文良
导　师: 刘鹏；陈云鹏
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 深绿木霉根癌农杆菌介导转化(ATMT) 敌敌畏生物降解固定化
分类号: S481.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究成功建立了高效的农杆菌介导转化深绿木霉(Trichoderma atroviride)T23转化体系,转化效率可达50个转化子/107个孢子。从110株稳定遗传的突变株中筛选到7株敌敌畏降解率显著变化的突变子。其中两株(AMT-12和AMT-28)敌敌畏降解率较出发菌T23提高10%以上,生物学分析发现其产孢能力明显下降,但其对敌敌畏的耐受性与T23基本一致。另外,还有5株突变子AMT-18、AMT-25、AMT-44、AMT-64和AMT-92的降解率较T23降低70%,但产孢能力保持不变,它们对敌敌畏的耐受能力是T23的4倍(800μg/mL)。Southern杂交检测证实AMT-12和AMT-28是T-DNA单拷贝插入突变子,而另外5株降解率下降的突变子为T-DNA多拷贝插入。我们克隆了突变株AMT-12和AMT-28的侧翼序列,其长度分别为1845bp和1730bp。经BLAST分析发现序列与深绿木霉测序菌株IMI206040分别具有89%和88%的相似性。但是,这2个侧翼序列所在的基因与降解敌敌畏的关系还需深入研究。为了深入研究木霉在处理敌敌畏废水中的作用,试验以突变株AMT-28为例,采用海藻酸钙滴珠法建立了其孢子固定化技术体系,并探讨了深绿木霉菌生物降解敌敌畏的可能机制。在纯培养条件下,以海藻酸钙固定107个孢子(107孢子/100mL的3%海藻酸钠悬液)降解敌敌畏的效果最好。与固定化菌丝和非固定化菌丝相比,固定化孢子对敌敌畏的降解率有显著性提高。在重复利用实验中,固定化孢子和固定化菌丝小球在5个连续批次测试中显示了良好的降解能力,且随着批次增加,固定化孢子对敌敌畏的降解率有一定程度的提高。固定化菌丝小球在储存一个月后,其降解能力大大下降,而固定化孢子非但没有下降,还有某种程度的提高。为了监测菌丝体对敌敌畏的降解情况,实验中采用了HPLC法分析了突变株AMT-28的发酵液,确认AMT-28能够在7天内完全降解敌敌畏。同时,利用缺陷培养基纯培养发现,AMT-28能够在无外加碳源或者磷源的情况下降解敌敌畏,氮元素对AMT-28降解敌敌畏的影响很大。解吸附实验证实敌敌畏的减少是由于木霉的生物降解而非吸附作用。酶定位研究结果提示深绿木霉菌T23中存在诱导型胞内敌敌畏降解酶。实验末期降解液的pH与敌敌畏添加初始浓度成正相关,由此推测木霉降解敌敌畏是通过生物矿化作用完成的。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
1 文献综述  11-21
  1.1 有机磷农药残留的微生物降解概述  12-15
    1.1.1 有机磷农药的结构和解毒  12-14
    1.1.2 生物修复治理有机磷农药污染  14
    1.1.3 微生物降解有机磷农药的作用方式  14
    1.1.4 有机磷降解酶和相关基因  14-15
  1.2 敌敌畏的降解  15-17
    1.2.1 敌敌畏的非生物作用降解途径  15-16
    1.2.2 敌敌畏的生物降解途径  16-17
  1.3 本论文立题依据、目的及意义  17-21
2 深绿木霉菌T23的有机磷农药降解谱  21-26
  2.1 材料和方法  21-23
    2.1.1 仪器与药品  21-22
    2.1.2 测定方法  22-23
  2.2 结果与分析  23-25
    2.2.1 毒死蜱  23
    2.2.2 甲基对硫磷  23-24
    2.2.3 敌敌畏  24-25
  2.3 讨论  25-26
3 深绿木霉菌ATMT转化体系的建立与优化  26-37
  3.1 材料和方法  26-32
    3.1.1 药品与试剂  26-27
    3.1.2 储备原液  27-31
    3.1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化  31
    3.1.4 ATMT转化体系的优化  31
    3.1.5 转化子的稳定性测定  31
    3.1.6 转化子的PCR检测  31-32
  3.2 结果与分析  32-35
    3.2.1 深绿木霉T23对潮霉素的敏感性  33
    3.2.2 农杆菌的培养时间  33
    3.2.3 遗传稳定性分析  33-34
    3.2.4 PCR检验  34-35
  3.3 讨论  35-37
4 突变子敌敌畏降解能力测定及目标转化子的形态学观察  37-49
  4.1 方法  37-43
    4.1.1 转化子降解能力的测定  37-38
    4.1.2 目标转化子敌敌畏耐受性测定  38
    4.1.3 目标转化子的基本生物学特征  38
    4.1.4 目标转化子的Southern blot分析  38
    4.1.5 目标准化子侧翼序列的扩增  38-43
  4.2 结果与分析  43-48
    4.2.1 转化子敌敌畏降解率测定结果  43
    4.2.2 目标准化子的形态学变化  43-44
    4.2.3 目标转化子侧翼序列的克隆  44-48
  4.3 讨论  48-49
5 固定化应用及降解机理初探  49-61
  5.1 方法  49-52
    5.1.1 菌株  49-50
    5.1.2 固定化小球的制备  50
    5.1.3 样品中敌敌畏残留的检测  50
    5.1.4 固定化AMT-28生物降解敌敌畏的研究  50-51
    5.1.5 AMT-28的敌敌畏生物降解机理初探  51-52
  5.2 结果与讨论  52-61
    5.2.1 孢子固定化小球降解敌敌畏能力研究  52-54
    5.2.2 AMT-28孢子固定化小球的存储稳定性和反复使用研究  54-55
    5.2.3 最佳固定化方式的确定  55-56
    5.2.4 AMT-28对敌敌畏的生物降解机制  56-61
总结  61-62
参考文献  62-74
攻读学位期间取得的研究成果  74-75
致谢  75-76

根癌农杆菌介导深绿木霉（Trichoderma atroviride）T23转化体系的建立以及高效降解敌敌畏突变株筛选与应用研究

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