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核苷类创新药美他卡韦体内线粒体毒性研究

作　者: 赵军军
导　师: 陈正礼
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猕猴 Metacavir 线粒体超微结构线粒体呼吸链复合体活性 mtDNA
分类号: S859
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：采用猕猴(恒河猴)为动物模型评价抗乙肝新药—美他卡韦(Metacavir)是否具有潜在的线粒体毒性及其严重程度,为临床安全用药提供参考依据。方法：(1)动物分组及剂量设计：27只猕猴共分5组,阳性对照组[齐多夫定(AZT)组,3只]、Metacavir高、中、低剂量组和对照组(各6只)。Metacavir各剂量组分别设给药期(3个月)和恢复期(4周,各2只)。剂量为AZT 50mg/kg; Metacavir高剂量组120mg/kg,中剂量组40mg/kg,低剂量组13mg/kg,对照组为生理盐水。给药途径：AZT组为口服给药,Metacavir各组为静脉注射给药。给药频率：每周6次,每日上午9-12时给药。(2)临床症状观察。(3)HE染色光镜观察各组组织病理学变化。(4)透射电镜观察肝脏、肾脏、心肌和骨骼肌线粒体超微结构变化。(5)分光光度法测定肝脏、肾脏、心肌和骨骼肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ-Ⅳ活性变化。(6)定量PCR检测肝脏、肾脏、心肌和骨骼肌mtDNA含量变化。结果：(1)临床观察：AZT组动物给药期出现恶心、呕吐,食欲降低,Metacavir给药期未见明显临床症状。(2)组织病理学观察结果：给药期高剂量组动物(4/4只)肝脏、小肠、胃、肾均出现不同程度病变。中剂量组动物(4/4只)肝、肾出现病变,部分动物(3/4只)胃、小肠(1/4只)有病理变化。高剂量组、中剂量组其它组织及对照组、低剂量组各组织均未见异常剖检病变和组织病理变化。AZT组动物肝脏和肾脏均出现病变。恢复期所有剂量组组织未见异常病理学变化。(3)透射电镜观察结果：首次给药3月,对照组动物和Metacavir 40mg/kg组显示肝、肾、心肌和骨骼肌未见线粒体形态变化；Metacavir 120mg/kg组肾、心肌线粒体形态结构正常,肝细胞糖原颗粒减少，骨骼肌部分线粒体嵴断裂。恢复期均未见异常病理性变化。AZT 50 mg/kg组肝、’肾、心肌和骨骼肌均出现一定病理变化。(4)线粒体呼吸链复合体活性检测结果：①复合体Ⅰ：首次给药3月,与对照组比,AZT组肝脏、肾脏、心肌和骨骼肌活性极显著降低约50%(P<0.01),Metacavir 120 mg/kg组肝脏、心肌和骨骼肌活性显著下降(P<0.05)；其他各组及恢复期各组活性与同期对照组相比无显著性差异。②复合体Ⅱ：给药3月,与对照组比,AZT 50mg/kg组心肌和骨骼肌活性极显著降低(P<0.01),肝脏活性显著降低(P<0.05),肾脏活性有降低趋势,但无统计学差异；Metacavir 120mg/kg组心肌和骨骼肌活性显著下降(P<0.05)。其他各组及恢复期各组活性与同期对照组比无显著性差异。③复合体Ⅲ：首次给药3月,与对照组比,AZT 50mg/kg组肝、肾和骨骼肌活性极显著下降(P<0.01),心肌活性显著下降(P<0.05)；Metacavir各组与对照组比均无显著性差异。恢复期各组活性与同期对照组比无显著性差异。④复合体Ⅳ：首次给药3月,AZT 50mg/kg组心肌活性极显著下降(P<0.01),肾脏和骨骼肌活性显著下降(P<0.05)；Metacavir各组与对照组比均无显著性差异。恢复期各组活性与同期对照组比无显著性差异。(5)mtDNA含量检测结果：QPCR技术对mtDNA(Cytb基因)和核DNA(Actin基因)定量。实验3个月后,与对照组比,AZT 50mg/kg组骨骼肌、心肌、肝脏mtDNA含量极显著降低70%以上(P<0.01),肾mtDNA含量显著降低(P<0.05)；Metacavir 120mg/kg组骨骼肌、肝脏mtDNA含量显著降低(P<0.05),心肌mtDNA含量极显著降低(P<0.01),但均高于AZT 50mg/kg组,恢复期4周,Metacavir 120mg/kg组各组织mtDNA含量有上升趋势。结论：(1)AZT在50mg/kg剂量下,猕猴连续口服3月对骨骼肌、心肌、肾脏、肝脏组织线粒体存在明显结构改变和功能障碍；同时呼吸链复合体活性和mtDNA含量(拷贝数)降低。(2)Metacavir 120mg/kg剂量下对骨骼肌、心肌、肝脏表现出一定的线粒体损伤,其损伤程度：骨骼肌>肝脏、心肌,对肾脏线粒体损伤弱,停药4周毒性反应指标有恢复趋势；Metacavir 120mg/kg剂量对线粒体的损伤程度比AZT 50mg/kg弱。(3)Metacavir 40mg/kg组对各组织未见明显线粒体损伤,对动物线粒体功能不构成影响,可为临床设计人用剂量和主要观察指标提供参考依据。(4)Metacavir对猕猴没有潜在的线粒体毒性,且Metacavir对机体的损伤是可逆的。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
1.前言  12-13
2.文献综述  13-23
  2.1 研究概述  13-23
    2.1.1 核苷类药物概述  13-19
    2.1.2 线粒体概述  19-22
    2.1.3 研究核苷类药物线粒体毒性的意义  22-23
  2.2 研究目的  23
3.实验操作  23-44
  3.1 试验材料  23-26
    3.1.1 供试品及对照品  23-24
    3.1.2 试验动物及饲养  24-25
    3.1.3 主要仪器  25
    3.1.4 主要试剂  25-26
  3.2 试验方法  26-44
    3.2.1 动物分组及剂量设计  26-27
    3.2.2 给药途径及方法  27
    3.2.3 试验动物临床观察  27
    3.2.4 动物剖检与病理学检查  27-28
    3.2.5 线粒体提取  28
    3.2.6 线粒体溶解与线粒体蛋白含量测定  28-30
    3.2.7 线粒体复合体活性测定  30-36
    3.2.8 QPCR技术分析Metacavir对猕猴线粒体mtDNA含量的影响  36-44
    3.2.9 数据处理  44
4.试验结果  44-60
  4.1 临床观察结果  44
  4.2 动物剖检及病理学检查结果  44-52
    4.2.1 动物剖检结果  44
    4.2.2 组织病理学检查结果  44-47
    4.2.3 透射电镜观察线粒体结果  47-52
  4.3 线粒体蛋白浓度测定结果  52-53
  4.4 各组织线粒体呼吸链复合体活性测定结果  53-57
    4.4.1 线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性测定结果  53-54
    4.4.2 线粒体呼吸链复合体Ⅱ(琥珀酸-CoQ还原酶)活性测定结果  54-55
    4.4.3 线粒体呼吸链复合体Ⅲ(CoQ-细胞色素C还原酶)活性测定结果  55-56
    4.4.4 线粒体呼吸链复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶)活性测定结果  56-57
  4.5 mtDNA含量测定结果  57-60
    4.5.1 Cytb基因和Actin基因PCR扩增产物凝胶电泳结果  57-59
    4.5.2 核酸浓度检测结果  59
    4.5.3 Real-Time PCR扩增线粒体Cytb基因条件的优化结果  59
    4.5.4 Real-Time PCR扩增核Actin基因条件的优化结果  59
    4.5.5 Real-Time PCR对样品线粒体Cytb基因和Actin基因的定量结果  59-60
5.分析与讨论  60-66
  5.1 试验系统的选择依据  60
  5.2 药物剂量设计依据  60-61
  5.3 Metacavir对动物临床和组织病理的影响  61-62
  5.4 Metacavir对动物线粒体形态结构的影响  62-64
  5.5 Metacavir对动物线粒体呼吸链复合体活性的影响  64-65
  5.6 Metacavir对动物mtDNA含量影响  65-66
6.结论  66-67
参考文献  67-76
致谢  76

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