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内共生菌Wolbachia对中国二斑叶螨自然种群线粒体DNA多样性及其进化的影响

作　者: 于明志
导　师: 洪晓月
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: Wolbachia mtDNA多样性二斑叶螨中性检测
分类号: S433.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

二斑叶螨Tetranychus urticae Koch属于蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨目Acariformes、叶螨科Tetranychidae,是一种危害果蔬和温室作物的世界范围的重要经济害虫。研究发现,在中国二斑叶螨体内广泛感染Wolbachia。Wolbachia是一种细胞内共生菌,广泛存在于节肢动物体内,可通过宿主卵的细胞质进行母系遗传。Wolbachia通过诱导胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility, CI)、诱导雌性化(feminization)、诱导孤雌生殖(parthenogenesis)和杀雄作用(male-killing)四种方式调控寄主的生殖行为,以实现其在寄主种群中的稳定存在和扩散。同Wolbachia一样,昆虫线粒体也属于母系遗传,在感染Wolbachia的昆虫个体中,Wolbachia和线粒体一起通过细胞质进行遗传。线粒体基因组具有基因排列顺序非常保守紧凑、基因间隔区较小或者不存在、很少出现串联重复序列、极少发生重组以及进化速率快等特点,使其成为比较基因组学与进化研究的理想系统。最近一些学者研究指出,与其它基因组基因相比,线粒体基因实际上处于十分强烈的选择压力之下,接受着来自线粒体本身的直接选择和其他母系遗传因素的间接选择,也就是说,由于Wolbachia的存在,会对其宿主1mtDNA多样性产生影响,从而对寄主种群的遗传结构、生物地理学及进化研究产生影响。本研究通过PCR检测Wolbachia在二斑叶螨各地理种群中的感染情况,通过基因序列比对进行系统发育分析,确定Wolbachia品系。同时测定其相应mtDNA-COI基因(mitochondrial cytochrome oxidase I, COI)的序列,即分别PCR扩增各地理种群感染Wolbachia和不感染Wolbachia个体COI序列,测序后对两者线粒体DNA多样性进行分析,从分子水平上分析Wolbachia是否对二斑叶螨mtDNA多样性和进化产生影响。在本研究选用的二斑叶螨自然种群内,共检测到四种株系的Wolbachia,分别为wUrtOri1、wUrtOri2、wUrtOri3和wUrtCon1。其中wUrtOri1是分布最广泛的株系。我们根据二斑叶螨种群中Wolbachia的感染情况,共挑取感染Wolbachia的个体98头,挑取不感染Wolbachia的个体110头进行COI基因的扩增,得到198条COI序列,共存在69个多态位点,其中6个为同义位点,可以划分为13种单倍型。在感染Wolbachia的种群中存在8种单倍型,在不感染(?)Wolbachia的种群中存在12种单倍型。13种单倍型中有9种是共享单倍型,在多个种群中都有分布；4个为独享单倍型,相应的存在于四个不同的自然种群中。HaploI是最常见的单倍型,分布在5个种群中。HaploF是分布第二广泛的单倍型,分布在3个种群中,而HaploB分布最少,只存在在一个种群中。同一种株系的Wolbachia在多种单倍型中都有分布,并且在同一种单倍型中,同时存在感染Wolbachia个体和不感染Wolbachia个体,：ntDNA数据没有同wsp数据形成严格对应关系。本实验利用rntDNA-COI序列,通过分子变异分析(AMOVA)来研究中国二斑叶螨自然种群间的遗传差异。研究结果表明,中国二斑叶螨各地理种群间差异显著。并且二斑叶螨种群中的变异主要来自种群内部的个体间,占总变异的80%以上。AMOVA分析结果表明,除了感染wUrtOri3株系和双感染(?)vUrtOri2/ wUrtOri3(?)(?)种群个体外,其它感染Wolbachia的个体与不感染Wolbachia个体之间mtDNA多样性具有显著的差异。我们利用mtDNA-COI序列,通过比较二斑叶螨个体mtDNA单倍型多样性、核酸多样性和核苷酸平均差异来研究二斑叶螨种群的遗传进化。研究结果表明,感染Wolbachia个体的线粒体单倍型多样性和核苷酸多样性比不感染Wolbachia个体显著下降；中性检测结果表明在感染Wolbachia个体中,Tajima’s D和Fu & Li’s F值都是负值,表明中国二斑叶螨种群受到了Wolbachia不同程度的选择作用；同时,MacDonald-Kreitman (M-K)检测结果显示只有在不感染Wolbachia个体中是显著的,而在感染Wolbachia(?)勺种群个体中结果都不显著,说明Wolbachia对二斑叶螨mtDNA多样性产生了影响,但是二斑叶螨种群没有显著偏离中性平衡。另外,中性检测不能全面解释Wolbachia对二斑叶螨线粒体多样性的影响作用,在以后的实验中应该结合其它手段综合研究,取得更加全面准确的实验结果。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-10第一章文献综述 10-26 1 Wolbachia的研究概况 10-17 1.1 Wolbachia的形态及在宿主体内的分布 11 1.2 Wolbachia的系统分类 11-13 1.3 Wolbachia的传播规律 13-14 1.4 Wolbachia的分子检测技术 14-15 1.5 叶螨中Wolbachia的研究进展 15-17 2 线粒体DNA在叶螨中的应用 17-20 2.1 线粒体DNA的特点 17-18 2.2 线粒体DNA在叶螨中的应用 18-20 3 Wolbachia与寄主mtDNA的相互关系 20-24 3.1 Wolbachia在种群内对mtDNA产生的影响 20-23 3.2 Wolbachia在种群间对mtDNA产生的影响 23-24 4 二斑叶螨在我国的发生与危害 24-26第二章共生菌Wolbachia在中国二斑叶螨自然种群的感染规律 26-38 1 材料与方法 27-31 1.1 供试材料 27-29 1.2 二斑叶螨总DNA的提取 29 1.3 PCR检测二斑叶螨体内的Wolbachia 29-30 1.4 PCR产物纯化 30 1.5 连接和转化反应 30-31 1.6 序列测定和分析 31 2 结果与分析 31-32 2.1 二斑叶螨体内Wolbachia的感染情况 32 2.2 二斑叶螨体内Wolbachia的wsp序列分析 32 3 讨论 32-38第三章中国二斑叶螨自然种群线粒体DNA-COI的扩增与系统发育分析 38-52 1 材料与方法 39-42 1.1 供试材料 39-41 1.2 叶螨总DNA的提取 41 1.3 PCR检测二斑叶螨体内的Wolbachia 41 1.4 二斑叶螨种群COI的扩增 41-42 1.5 PCR产物纯化 42 1.6 序列测定和分析 42 2 结果与分析 42-49 2.1 二斑叶螨体内Wolbachia的感染情况及wsp序列分析 42-44 2.2 二斑叶螨体内COI序列分析 44-49 3 讨论 49-52第四章 Wolbachia对中国二斑叶螨自然种群线粒体DNA多样性及其进化的影响 52-64 1 材料与方法 53-55 1.1 供试材料 53 1.2 叶螨总DNA的提取 53 1.3 PCR检测二斑叶螨体内的Wolbachia 53 1.4 二斑叶螨种群COI的扩增 53 1.5 PCR产物纯化 53 1.6 序列测定和分析 53-54 1.7 系统发育分析 54 1.8 种群遗传差异分析 54 1.9 种群分子进化分析 54-55 2 结果与分析 55-62 2.1 二斑叶螨体内Wolbachia的感染情况及wsp序列分析 55 2.2 二斑叶螨体内COI序列分析 55 2.3 种群系统发育分析 55-56 2.4 种群遗传差异分析 56-59 2.5 种群分子进化分析 59-62 3 讨论 62-64全文总结 64-66参考文献 66-80学术论文发表情况 80-82致谢 82

内共生菌Wolbachia对中国二斑叶螨自然种群线粒体DNA多样性及其进化的影响

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