|
目的肾小球系膜细胞在维护肾小球结构完整和功能调节等方面起到关键作用,其增生失控及相应结构重塑是导致肾小球硬化的重要机制,TGFβ1导致胞外基质集聚及纤维化,CTGF是TGF-β1致纤维化的重要的下游介质。本研究构建TGF-β1系膜细胞增殖模型,观察槐杞黄对TGF-β1介导的系膜细胞增殖和细胞周期时相以及CTGF表达水平的影响,并探讨Smad和ERK信号通路在其中的作用。方法1.培养大鼠系膜细胞,不同浓度的槐杞黄(0ng/ml,6ng/ml,12ng/ml,18ng/ml)预孵育12h,加2ng/mlTGFβ1继续作用24h,MTT法检测细胞增殖率。2.在培养的系膜细胞对数生长期,加入不同浓度的槐杞黄(0ng/ml,6ng/ml,12ng/ml,18ng/ml)预孵育12h,与此基础上2ng/mlTGFβ1作用24h,流式细胞仪分析细胞周期。3.以2ng/ml TGFβ1刺激系膜细胞(0,1,2,3,6,9,12,24,48h),Westernblot动态观察CTGF蛋白表达。4.不同浓度的槐杞黄(0ng/ml,6ng/ml,12ng/ml,18ng/ml)与系膜细胞预孵育12h,加2ng/mlTGFβ1作用2h,观察不同浓度的槐杞黄对CTGF表达的影响。5.观察TGFβ1诱导相关信号通路蛋白磷酸化以及核转位情况,探讨槐杞黄抑制CTGF表达的作用机制。结果1.MTT结果显示:槐杞黄6ng/ml时候即可显示20%细胞生长抑制率,其后浓度越高,抑制效应越强,在18ng/ml时候达到60%。提示槐杞黄以浓度依赖的方式抑制系膜细胞的增殖(P<0.05)。2.流式细胞仪检测显示:与对照组相比,槐杞黄处理细胞后,GO/G1期细胞的比例上升,而S期和G2/M期细胞相应减少,差异具有显著性(P<0.05),提示细胞停滞在GO/G1期,并且随着浓度的增高,细胞阻滞在GO/G1期的比例增多。3.Westernblot显示在TGF-β1作用系膜细胞1h即见CTGF蛋白表达增强,2h达到峰值,而槐杞黄以浓度依赖方式抑制CTGF表达。4.TGF- 1作用系膜细胞1h即见Smad2磷酸化,且表达水平维持6h后逐渐下降;槐杞黄预处理细胞12h,可以部分阻断TGF- 1诱导的Smad2磷酸化。5.TGF- 1可诱导系膜细胞ERK1/2磷酸化,2h时ERK1/2磷酸化水平达到高峰,以后逐渐下降,而总ERK1/2蛋白水平比较稳定;槐杞黄不影响TGF- 1诱导的ERK1/2磷酸化水平。6.TGF- 1作用2h后,系膜细胞胞核中的磷酸化Smad2、总Smad2/3、Smad4水平增加,而槐杞黄预处理12h ,可以明显抑制TGF- 1诱导的p-Smad2,Smad2/3,Smad4的核转位。结论槐杞黄以浓度依赖的方式抑制大鼠系膜细胞的增殖和结缔组织生长因子CTGF的表达,其调控机制可能与抑制TGF-β1-smad2信号通路有关,通过减弱Smad2磷酸化水平,以及抑制P-Smad,Smad2/3,Smad4核转位进而抑制结缔组织生长因子表达,抑制系膜细胞增殖。
|