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A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

作　者: 康忠惠
导　师: 许修宏
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 禽白血病禽白血病病毒 ALV-A ALV-B LAMP 可视化
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的以肿瘤发生和免疫抑制为特征的世界范围的禽类疾病。禽白血病病毒属于反转录病毒科,α反转录病毒属。感染鸡的禽白血病病毒可分为外源性的A、B、C、D、J亚群和内源性的E亚群。目前,世界各国控制禽白血病的主要方法是通过病原检测,淘汰阳性鸡,从而净化种群达到消灭本病的目的。因此,在该病的控制中及时准确的诊断就显得尤为重要。目前,基于核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、实时荧光定量PCR等在病原微生物的检测以及疾病诊断方面发挥着重大作用,但这些方法要么需要精密仪器,要么要求操作人员具备较高的专业知识和操作技能,因此不利于在基层推广,无法满足简单、快速、准确诊断的要求。而传染病的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确的检测并确诊。因此,建立一种快速、准确的新型诊断技术迫在眉睫。本研究根据序列对比结果和禽白血病亚群间序列特征,针对gp85区段设计了两组分别用于检测A、B亚群禽白血病的LAMP引物。通过对反应条件的优化,使得A、B亚群的LAMP检测方法不与除本身亚群外的其它禽白血病主要亚群发生交叉反应,同时也不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。ALV-A的LAMP方法敏感性试验表明:该方法能够在45分钟内检测出20个拷贝的病毒核酸,比常规PCR敏感100倍。ALV-B的LAMP方法敏感性试验表明:该方法在80min内能够检测出4000个拷贝的病毒核酸,与普通PCR敏感度相当。LAMP检测方法的建立实现了对A、B亚群的快速检测,而且可通过添加荧光染料FDR,使其反应前后颜色发生显著变化来进行判定,实现了反应产物的可视化。整个反应过程不需要开盖,极大地减少了污染的可能性,具有现地应用的前景。综上所述,本研究成功建立了A、B亚群禽白血病的LAMP检测方法。为今后的相关研究奠定了理论基础。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 前言  11-25
  1.1 研究的目的与意义  11-12
  1.2 文献综述  12-19
    1.2.1 禽白血病  12-13
    1.2.2 禽白血病病毒  13-14
    1.2.3 病毒基因组的结构和功能  14-16
    1.2.4 禽白血病病毒的致病机制  16
    1.2.5 禽白血病检测方法的研究进展  16-19
  1.3 环介导等温扩增（LAMP）技术  19-25
    1.3.1 环介导等温扩增方法引物设计  19-20
    1.3.2 环介导等温扩增方法基本原理  20-23
    1.3.3 环介导等温扩增方法特点  23-25
2 材料与方法  25-39
  2.1 菌株来源  25
  2.2 试验材料、仪器  25-27
    2.2.1 常用试剂  25
    2.2.2 试剂配制  25-26
    2.2.3 仪器设备  26-27
  2.3 A 亚群禽白血病病毒LAMP 检测方法的建立  27-34
    2.3.1 病毒的培养与增殖  27
    2.3.2 病毒基因组的提取  27-28
    2.3.3 质粒标准品的构建  28-30
    2.3.4 ALV-A LAMP 引物的设计  30-32
    2.3.5 ALV-A LAMP 反应时间、温度的优化  32
    2.3.6 ALV-A LAMP 与其它亚群的区分  32
    2.3.7 ALV-A LAMP 的特异性试验  32
    2.3.8 ALV-A LAMP 的敏感性试验  32-33
    2.3.9 ALV-A 临床样品的检测  33-34
  2.4 B 亚群禽白血病病毒LAMP 检测方法的建立  34-39
    2.4.1 病毒的培养与增殖  34
    2.4.2 病毒基因组的提取  34
    2.4.3 质粒标准品的构建  34-35
    2.4.4 ALV-B LAMP 引物的设计  35-37
    2.4.5 ALV-B LAMP 反应时间、温度的优化  37
    2.4.6 ALV-B LAMP 与其它亚群的区分  37
    2.4.7 ALV-B LAMP 的特异性试验  37
    2.4.8 ALV-B LAMP 的敏感性试验  37-38
    2.4.9 ALV-B 临床样品的检测  38-39
3 结果与分析  39-51
  3.1 A 亚群禽白血病LAMP 检测方法的建立  39-45
    3.1.1 ALV-A LAMP 质粒标准品的构建  39
    3.1.2 ALV-A LAMP 引物的筛选  39-40
    3.1.3 ALV-A LAMP 不与禽白血病的其它亚群发生交叉反应  40-41
    3.1.4 ALV-A LAMP 检测方法的特异性  41-42
    3.1.5 ALV-A LAMP 具有较高的敏感性  42-44
    3.1.6 ALV-A 临床样品的检测  44-45
  3.2 B 亚群禽白血病LAMP 检测方法的建立  45-51
    3.2.1 ALV-B LAMP 质粒标准品的构建  45-46
    3.2.2 ALV-B LAMP 引物的筛选  46-47
    3.2.3 ALV-B LAMP 不与禽白血病的其它亚群发生交叉反应  47
    3.2.4 ALV-B LAMP 不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应  47-49
    3.2.5 ALV-B LAMP 具有较高的敏感性  49-50
    3.2.6 ALV-B 临床样品的检测  50-51
4 讨论  51-54
  4.1 病毒增殖  51
  4.2 质粒标准品的制备  51
  4.3 LAMP 的特异性  51-52
  4.4 LAMP 的敏感性  52
    4.4.1 ALV-A LAMP 检测  52
    4.4.2 ALV-B LAMP 检测  52
  4.5 LAMP 的可视化  52
  4.6 A、B 亚群LAMP 检测方法建立的必要性  52-54
    4.6.1 A 亚群LAMP 检测方法建立的必要性  53
    4.6.2 B 亚群LAMP 检测方法建立的必要性  53-54
5 结论  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-60
攻读硕士学位期间发表的学术论文  60

A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

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