学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

基于新型功能化磁性纳米材料的磷酸化肽段和糖肽的富集研究

作　者: 戚大伟
导　师: 邓春晖
学　校: 复旦大学
专　业: 分析化学
关键词: 磷酸化蛋白/肽段糖蛋白/肽富集固定金属离子亲和色谱金属氧化物亲和色谱功能化磁球质谱
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 218次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

蛋白质的可逆磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰,它调节着如细胞信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动,也被形象地描述为细胞生理活动的分子开关。因此,对蛋白质磷酸化的研究有助于全面理解蛋白质的各项功能及其机理。现今,蛋白质磷酸化的研究方法是先将蛋白质酶解,而后利用生物质谱对磷酸化肽段的氨基酸序列和磷酸化位点进行准确地鉴定。但磷酸化蛋白质的含量较低,磷酸化肽段的离子化效率较差,且非磷酸化肽段的存在将严重抑制磷酸化肽段的质谱信号,这些原因导致利用质谱直接对磷酸化肽段进行准确分析面临很大困难。因此在质谱分析前需对磷酸化肽段进行选择性富集,而发展新型的富集技术成为当前蛋白组学研究的热点。蛋白质的糖基化是另一种重要的翻译后修饰。糖蛋白在分子识别、细胞成长、尤其是在免疫反应中都有着重要作用。现今糖蛋白已被用作癌症治疗、诊断和检测的标志物。虽然生物质谱技术有很大的进步,但对糖蛋白的鉴定和分析仍面临众多问题。为解决此问题,需在质谱分析前对糖蛋白或糖肽进行选择性富集,从而进一步提高检测方法的灵敏度。近来,磁性纳米材料基于自身磁性已应用于生物医学中的多个领域。而功能化磁球作为一种新型的分析技术已在蛋白质组学研究中得到广泛的应用。本论文针对上述蛋白质组学研究中的两个热点问题,将功能化磁球与蛋白质分析结合起来,开展了一系列研究工作,发展了相关的新技术新方法,并进行了实际的应用研究。主要研究内容和取得的研究成果摘要如下：第一章概述了蛋白质磷酸化和糖基化修饰的研究现状。首先介绍了蛋白质磷酸化的重要性及其特点。对现今磷酸化蛋白质研究中的生物质谱技术进行了简单地阐述。归纳并总结了磷酸化蛋白质／肽段的富集方法,对其原理和优缺点进行了介绍。然后简单介绍了糖蛋白的特点及现有的富集方法,并概述了功能化磁球在蛋白质组学研究中的应用。最后作者阐述了本论文的选题意义和目的。第二章首先利用一种新的简便方法将磷酸基团修饰于磁球表面。然后利用磷酸基团修饰磁球固定Zr4+离子并考察了其对磷酸化肽段的富集效果。基于Zou的报道,用磷酸基团作为螯合剂可使固定的金属离子更为稳定,同时有助于提高富集选择性。但现有的将磷酸基团修饰于磁球表面的方法过于繁杂,同时修饰过程中所使用的试剂有毒。本部分工作极大地简化了修饰过程,并将新制备的材料用于了磷酸化肽段的富集。第三章介绍了Fe3O4@C@Ta2O5磁球的合成方法及其在磷酸化肽段富集中的应用。本部分工作第一次将Ta2O5用于磷酸化肽段的富集。利用标准磷酸化蛋白对其富集效率和选择性进行评价,并将其用于实际样品中磷酸化肽段的富集。最后对比了Ta2O5和TiO2的富集差异性,发现二者之间存在着约50%的富集差异。第四章介绍了Fe3O4@C@SnO2磁球的合成方法及其在磷酸化肽段富集中的应用。基于Sturm的研究报道,SnO2对磷酸化肽段富集具有较高的选择性。但传统的溶胶凝胶法不适用于合成核壳结构的Fe3O4@C@SnO2磁球。本部分工作利用简单的两步水热反应和一步溶剂热反应,合成了Fe3O4@C@SnO2磁球。利用标准磷酸化蛋白对其富集效率和选择性进行评价,考察了SnO2和TiO2之间富集选择性的差异,证实SnO2较于TiO2具有更好的富集选择性。第五章利用简便快捷的自组装方法合成了核壳结构的Fe3O4@C@Au磁球。首先利用本实验组先前报道的方法合成了Fe3O4@C磁球。然后通过静电作用将PDDA修饰于Fe3O4@C磁球表面。由于Fe3O4@C磁球表面吸附了带正电荷的PDDA,因此可有效地吸附带负电荷的金纳米离子,从而合成了具有核壳结构的Fe3O4@C@Au磁球。硼酸是糖肽富集中常见方法,因此我们利用金和巯基基团间的相互作用,将硼酸基团修饰于Fe3O4@C@Au磁球表面。最后考察了新方法对糖蛋白和糖肽的富集效果。总之,本论文围绕磷酸化肽段与糖肽的富集新技术新方法,发展了多种新型功能化磁性材料,为解决磷酸化肽段或糖肽的分离富集及鉴定问题提供了有效的研究手段。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
第一章绪论  12-52
  1.1 磷酸化蛋白质组学概述  12-18
    1.1.1 蛋白质可逆磷酸化修饰  13-14
    1.1.2 磷酸化肽段及磷酸化位点的鉴定  14-18
      1) 碰撞诱导解离  14-16
      2) 电子捕获解离  16-17
      3) 电子转移解离  17-18
  1.2 磷酸化蛋白质/肽段的分离与富集  18-31
    1.2.1 免疫沉淀法  18
    1.2.2 化学修饰法  18-21
      1) 基于β消除反应  19-20
      2) 基于EDC催化反应  20-21
    1.2.3 液相色谱法  21-25
      1) 反相色谱  21-22
      2) 强阳离子交换色谱  22-23
      3) 强阴离子交换色谱  23-24
      4) 亲水相互作用色谱  24
      5) 静电排斥亲水相互作用色谱  24-25
    1.2.4 固定金属离子亲和色谱  25-27
    1.2.5 金属氧化物亲和色谱  27-30
    1.2.6 其它方法  30-31
      1) 磷酸钙沉淀法  30-31
      2) 聚精氨酸用于多磷酸化肽段富集  31
  1.3 糖蛋白/肽段的分离与富集  31-34
    1.3.1 凝集素亲和法  32-33
    1.3.2 硼酸法  33
    1.3.3 肼化学法  33-34
    1.3.4 亲水作用法  34
  1.4 磁性微球在蛋白质组学研究中的应用  34-37
    1.4.1 在固定化酶中的应用  35-36
    1.4.2 在磷酸化肽段或糖蛋白/肽富集中的应用  36-37
  1.5 本论文的选题意义  37
  1.6 参考文献  37-52
第二章简便合成磷酸基团修饰磁球固定金属离子用于磷酸肽段富集  52-71
  2.1 前言  52-53
  2.2 实验部分  53-58
    2.2.1 原料和试剂  53-54
    2.2.2 合成固定Zr~(4+)离子磁球  54
    2.2.3 表征固定Zr~(4+)离子磁球  54-55
    2.2.5 样品制备  55
    2.2.6 固定Zr~(4+)离子磁球选择性富集磷酸化肽段  55-56
    2.2.7 磷酸化和非磷酸化肽段富集后的回收率  56
    2.2.8 MALDI-TOF MS检测  56-57
    2.2.9 Nano-LC-ESI MS检测与数据处理  57-58
  2.3 结果与讨论  58-67
    2.3.1 固定Zr~(4+)离子磁球的合成与表征  58-60
    2.3.2 pH值对固定Zr~(4+)离子磁球富集选择性的影响  60-62
    2.3.3 固定Zr~(4+)离子磁球富集磷酸化肽段  62-67
  2.4 本章小结  67-68
  2.5 参考文献  68-71
第三章新型核壳结构五氧化二钽磁球用于磷酸化肽段选择性富集  71-85
  3.1 前言  71-72
  3.2 实验部分  72-76
    3.2.1 原料和试剂  72
    3.2.2 合成Fe_3O_4@C@Ta_2O_5磁球  72-73
    3.2.3 表征Fe_3O_4@C@Ta_2O_5磁球  73
    3.2.4 样品制备  73-74
    3.2.5 Fe_3O_4@C@Ta_2O_5磁球选择性富集磷酸化肽段  74
    3.2.6 MALDI-TOF MS检测  74-75
    3.2.7 Nano-LC-ESI MS检测与数据处理  75-76
  3.3 结果与讨论  76-81
    3.3.1 Fe_3O_4@C@Ta_2O_5磁球的合成与表征  76-77
    3.3.2 Fe_3O_4@C@Ta_2O_5磁球富集磷酸化肽段  77-79
    3.3.3 Ta_2O_5和TiO_2磷酸化肽段富集效果比较  79-81
  3.4 本章小结  81
  3.5 参考文献  81-85
第四章水热合成核壳结构二氧化锡磁球并用于磷酸化肽段选择性富集  85-104
  4.1 前言  85-86
  4.2 实验部分  86-90
    4.2.1 原料和试剂  86
    4.2.2 合成Fe_3O_4@C@SnO_2磁球  86-87
    4.2.3 表征Fe_3O_4@C@SnO_2磁球  87
    4.2.4 样品制备  87-88
    4.2.5 Fe_3O_4@C@SnO_2磁球选择性富集磷酸化肽段  88
    4.2.6 MALDI-TOF MS检测  88-89
    4.2.7 Nano-LC-ESI MS检测与数据处理  89-90
  4.3 结果与讨论  90-99
    4.3.1 Fe_3O_4@C@SnO_2磁球的合成与表征  90-94
    4.3.2 Fe_3O_4@C@SnO_2磁球富集磷酸化肽段  94-95
    4.3.3 SnO_2和TiO_2磷酸化肽段富集效果比较  95-99
  4.4 本章小结  99
  4.5 参考文献  99-104
第五章合成硼酸修饰的核壳结构磁性金球并用于糖肽选择性富集  104-117
  5.1 前言  104-105
  5.2 实验部分  105-108
    5.2.1 原料和试剂  105-106
    5.2.2 样品制备  106
    5.2.3 合成金纳米粒子  106
    5.2.4 合成硼酸修饰的Fe_3O_4@C@Au磁球  106-107
    5.2.5 Fe_3O_4@C@Au磁球上硼酸固定量测定  107
    5.2.6 表征Fe_3O_4@C@Au磁球  107
    5.2.7 硼酸修饰Fe_3O_4@C@Au磁球富集糖蛋白和糖肽  107-108
  5.3 结果与讨论  108-112
    5.3.1 硼酸修饰Fe_3O_4@C@Au磁球的合成与表征  108-111
    5.3.2 硼酸修饰Fe_3O_4@C@Au磁球富集糖肽和糖蛋白  111-112
  5.4 本章小结  112-113
  5.5 参考文献  113-117
附表1 固定锆(Ⅳ)离子磁球从鼠脑蛋白酶解液中富集到得磷酸化肽段  117-124
附表2 五氧化二钽磁球从鼠肝蛋白酶解液中富集到的磷酸化肽段  124-128
附表3 二氧化钛磁球从鼠肝蛋白酶解液中富集到的磷酸化肽段  128-132
附表4 二氧化锡磁球从鼠肝蛋白酶解液中富集到的磷酸化肽段  132-135
在校期间所发表论文  135-137
致谢  137-138

基于新型功能化磁性纳米材料的磷酸化肽段和糖肽的富集研究

内容摘要

全文目录

相似论文