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布氏杆菌新型疫苗的构建及免疫保护效果的研究

作　者: 罗德炎
导　师: 何凤田
学　校: 第三军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 布氏菌病保护性抗原 DNA疫苗蛋白疫苗单价疫苗双价疫苗细胞免疫体液免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 325次
引　用: 3次
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内容摘要

目的研制布氏菌病新型疫苗,为安全、有效的预防布氏菌病奠定基础。方法采用基因重组技术分别克隆编码布氏杆菌保护性抗原OMP16、L7/L12、BCSP31和P39的DNA片段以及OMP16-L7/L12、BCSP31-L7/L12和P39-L7/L12的融合DNA片段,继而分别构建于原核表达载体pET32a(+)并转化于大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导各重组蛋白的表达,进一步经亲和层析法对各重组蛋白抗原进行纯化。同时将以上所克隆的各DNA片段分别构建于真核表达载体pcDNA3.1(+),并转染于COS-7细胞,经免疫细胞化学法证实各目的蛋白在细胞中的表达。最后,用所制备的布氏菌病单价、双价候选DNA疫苗及重组蛋白疫苗分别免疫Balb/c小鼠,检测其免疫应答水平;用布氏杆菌强毒株0A544对免疫后的小鼠进行攻击试验,观察候选疫苗的免疫保护效果。结果 (1)所克隆的各DNA片段(除P39 DNA片段外)均与Genbank中的相应DNA序列一致。重组蛋白OMP16、L7/L12、BCSP31、P39、OMP16-L7/L12、BCSP31-L7/L12及P39-L7/L12在原核和真核细胞中均获得了表达。对原核系统表达的各重组蛋白进行了纯化。 (2)用各纯化的重组蛋白分别免疫Balb/c小鼠后,在小鼠血清中均可检测特异性抗体,效价分别高达1∶6,400—1:25,600之间,且双价重组蛋白所诱导产生的抗体效价高于单价,表明各重组蛋白均可激发良好的体液免疫,但没有诱导出明显的细胞免疫。攻毒试验表明重组蛋白所激发的这种免疫不能对布氏杆菌强毒株A544的攻击产生明显的保护力。 (3)用布氏菌病单价候选DNA疫苗免疫Balb/c鼠后,小鼠产生了有效的特异性体液免疫和细胞免疫。抗体亚型分类表明特异性IgG1/IgG2a小于1,说明产生了Th1型为主的免疫应答。T淋巴细胞增殖试验证实免疫小鼠脾脏T淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应增强;ELISPOT分析表明疫苗免疫组的特异性活化的可分泌IFN-γ的CD8~+T

全文目录

英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-8
中文摘要  8-10
论文正文  10-67
  前言  10-13
  第一章布氏杆菌保护性抗原分子的克隆、在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定  13-32
    第一节 OMP16、L7/L12、BCSP31和P39DNA的克隆、在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定  13-24
    第二节 OMP16-L7/L12、BCSP31-L7/L12和P39-L7/L12 DNA的克隆、在大肠杆菌表达、纯化和鉴定  24-32
  第二章布氏杆菌保护性抗原分子的克隆、在真核细胞中表达和鉴定  32-41
    第一节 OMP16、L7/L12、BCSP31和P39 DNA的克隆、在COS-7中表达和鉴定  32-36
    第二节 OMP16-L7/L12、BCSP31-L7/L12和P39-L7/L12 DNA的克隆、在 COS-7表达和鉴定  36-41
  第三章布氏菌病新型疫苗免疫效果的初步研究  41-55
  讨论  55-62
  参考文献  62-66
  致谢  66-67
文献综述一浅析布氏杆菌感染致病及免疫防御机制  67-76
  参考文献  73-76
文献综述二布氏菌病疫苗的研究进展  76-85
  参考文献  82-85
发表论文情况  85-86
附隆质粒构建流程图  86-87

布氏杆菌新型疫苗的构建及免疫保护效果的研究

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