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噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成酶相互作用及环二肽对类胡萝卜素合成调控的研究

作　者: 提婕
导　师: 李荣贵
学　校: 青岛大学
专　业: 微生物学
关键词: 类胡萝卜素 GGPP合成酶 八氢番茄红素合成酶 环二肽
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


类胡萝卜素(carotenoids)是一类呈现黄色、橙色或红色的功能性天然色素,广泛存在于自然界中,并且具有多种生物功能,尤其在保护人类健康方面起着重要作用。虽然类胡萝卜素在植物和微生物中含量丰富,但从野生生物中进行单一色素的提取和合成酶复合体的纯化都比较困难。近几年,随着不同生物类胡萝卜素合成基因的相继克隆和合成途径中相关酶的纯化以及类胡萝卜素生物合成途径的阐明,这为阐明类胡萝卜素合成的分子机理的研究提供了便利,也为利用微生物发酵来获取特定类胡萝卜素和运用基因工程手段调控类胡萝卜素的生物合成打下了基础。噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成代谢中的两个关键酶是GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶,本研究将编码GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶的基因crtE和crtB共转化大肠杆菌,IPTG诱导其表达,然后利用Ni2+树脂亲和层析和Superdex-75凝胶过滤层析纯化得到了一个重组蛋白复合体。Western blotting分析结合N-末端序列分析表明,GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶以两种复合体的形式存在。紫菌红素是类胡萝卜素的一种,荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescensGcM5-1A)能累积这种类胡萝卜素。环二肽(cyclic dipeptides)又叫2,5-二酮呢嗦的衍生物(2,5-diketopiperazine derivatives),荧光假单胞菌(P. fluorescensGcM5-1A)也能向胞外分泌环-(脯-酪氨酸),前期研究发现,该菌对紫菌红素和环-(脯-酪氨酸)的合成存在一定的相关性。本研究探讨了环-(脯-酪氨酸)对荧光假单胞菌细菌生长和合成类胡萝卜素的影响,同时利用SDS-PAGE研究了环-(脯-酪氨酸)对菌体内蛋白质代谢的影响。此外,利用Western blotting检测了环-(脯-酪氨酸)对荧光假单胞菌crtE基因的表达情况的影响。结果表明,环-(脯-酪氨酸)对荧光假单胞菌的生长没有影响,但对类胡萝卜素的合成具有促进作用；同时该化合物对35kDa附近菌体蛋白的表达有一定的促进作用,但对crtE基因的表达没有显著影响。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-7
引言  7-10
第一章 噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶的相互作用  10-16
  1.1 材料与方法  10-12
    1.1.1 菌种和试剂  10
    1.1.2 主要仪器  10
    1.1.3 实验方法  10-12
      1.1.3.1 重组质粒的构建  10-11
      1.1.3.2 crtE基因与crtB基因在大肠杆菌中的共表达及重组蛋白的纯化  11
      1.1.3.3 重组蛋白的Western blotting分析  11
      1.1.3.4 凝胶过滤法测定蛋白分子量  11
      1.1.3.5 蛋白浓度测定与SDS-PAGE分析  11-12
  1.2 结果与分析  12-15
    1.2.1 表达载体pET-15bcrtBE的构建  12
    1.2.2 crtE基因与crtB基因在大肠杆菌中的共表达  12-13
    1.2.3 蛋白标准曲线的制作  13
    1.2.4 GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶复合体的纯化  13-15
  1.3 讨论  15-16
第二章 环二肽对荧光假单胞菌类胡萝卜素合成的调控作用  16-23
  2.1 材料与方法  16-18
    2.1.1 菌种和试剂  16
    2.1.2 主要仪器  16
    2.1.3 实验方法  16-18
      2.1.3.1 菌种活化及接种培养  16
      2.1.3.2 环二肽的配制  16
      2.1.3.3 扩大培养  16-17
      2.1.3.4 菌体的收集与干湿重的测量  17
      2.1.3.5 菌体的破碎  17
      2.1.3.6 类胡萝卜素的提取和测定  17-18
      2.1.3.7 SDS-PAGE和Western-blotting  18
      2.1.3.8 荧光假单胞菌生长曲线及类胡萝卜素含量的测定  18
  2.2 结果与分析  18-22
    2.2.1 添加环二肽对荧光假单胞菌生长的影响  18-19
    2.2.2 添加环二肽对荧光假单胞菌类胡萝卜素含量的影响  19-20
    2.2.3 环二肽对荧光假单胞菌菌体蛋白的影响  20-22
  2.3 讨论  22-23
结论  23-24
参考文献  24-27
综述  27-44
  1 类胡萝卜素的功能及合成途径  28-33
    1.1 类胡萝卜素的功能  28-31
      1.1.1 类胡萝卜素具有抗氧化的功能  28
      1.1.2 类胡萝卜素的着色功能  28
      1.1.3 类胡萝卜素对人体的作用  28-31
        1.1.3.1 维生素A原  28-29
        1.1.3.2 防癌作用  29-30
        1.1.3.3 增强免疫功能  30
        1.1.3.4 防止老年人视黄斑退化的作用  30-31
    1.2 类胡萝卜素的生物合成途径  31-33
  2 类胡萝卜素生物合成途径的酶及其基因  33-34
  3 真核微生物发酵生产类胡萝卜素的研究  34-35
  4 原核微生物发酵生产类胡萝卜素的研究  35
  5 基因工程菌生产类胡萝卜素研究现状和发展趋势  35-37
  6 微生物产类胡萝卜素的应用  37-38
  7 问题和展望  38-39
  参考文献  39-44
攻读学位期间的研究成果  44-45
附录  45-47
致谢  47-48

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因的表达
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