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超顺磁性蛋白微球荧光免疫分析急性心肌梗塞早期标志物的研究

作　者: 王雪琴
导　师: 童德文；王进义
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 免疫磁珠急性心肌梗塞肌红蛋白心型脂肪酸结合蛋白荧光免疫分析
分类号: R542.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

免疫分析是生物学中一种重要的分析方法,由于抗原-抗体反应具有特异性高、检测限低、适用性广、以及极高的选择性和灵敏度等特点,免疫分析现已成为临床诊断、生物医药等研究领域中一种有效的分析手段;但常规免疫分析技术存在的一些缺陷限制了其在临床检验中的广泛应用。免疫磁珠( immunomagnetic beads, IMBs)技术是近年来发展起来一项新的免疫学技术,该技术把固相化试剂特有的优点与免疫学的高度特异性和灵敏度结合起来,大大改良了免疫分析检测的性能,基于IMBs的诸多优点,IMBs技术在科研和临床上有着广阔的应用前景。生物素-亲合素系统(biotin-avidin system,BAS)是70年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。把BAS与免疫分析偶联起来,可大大提高免疫分析的灵敏度,由于生物素-亲和素之间高度的亲和力、强烈的特异性、良好的稳定性及桥联作用,BAS系统已被广泛用于免疫分析研究中。根据超顺磁性微球的特性及磁场免疫分析技术原理,以自制超顺磁性γ-Fe2O3/HSA蛋白微球为固相载体,通过生物素-亲和素的桥联作用连接捕获抗体和固相载体,以荧光标记抗体作为检测抗体,利用荧光显微镜和荧光分光光度计为检测仪器,我们成功建立了基于超顺磁珠的AMI早期标志蛋白H-FABP/Myo的双抗体夹心荧光免疫分析技术,获得得主要结果和结论如下:1. Fe3O4/γ-Fe2O3纳米颗粒的制备与表征首先采用部分还原共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米颗粒,然后以Fe3O4为前驱材料,通过盐酸酸化、空气氧化的方法制备了γ-Fe2O3纳米颗粒,经表征γ-Fe2O3纳米颗粒粒径为10-15 nm,且颗粒分布均匀、分散性好,并具有良好的超顺磁性。2. HSA/γ-Fe2O3超顺磁性微球的合成、表征与亲和素修饰以自制超顺磁性γ-Fe2O3纳米颗粒为前提材料,采用改进的高温乳化法制备HSA/γ-Fe2O3微球。表征结果表明我们制备出表面光滑圆整、分散性好,平均粒径为8μm的蛋白磁性微球,蛋白微球磁响应性能良好,具有超顺磁性。利用异源双功能交联剂Sulfo-SMCC/SATA对人血清白蛋白超顺磁性微球表面亲和素修饰,经BCA蛋白试剂盒检测,亲和素与蛋白微球的偶联量为67 mg/g。3.捕获抗体Anti-FABP10E1/ Anti-Myo7C3生物素化及HSA/γ-Fe2O3微球连接利用EZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit进行捕获抗体的生物素化;并通过HABA方法测定生物素与抗体结合的数量。根据BCA实验与HABA实验检测结果:0.1 mg/mL生物素化的anti-Myo7C3与anti-FABP10E1(100μL)分别需要结合16μL与11μL avidin修饰蛋白微球。4.检测抗体Anti-Myo4E2/Anti-FABP9F3的荧光标记及浓度检测。利用MicroBCA试剂盒检测荧光标记检测抗体Alexa fluor 594标记anti-Myo 4E2 and FITC标记anti-FABP 9F3的浓度。结果表明Alexa fluor 594标记anti-Myo 4E2 and FITC标记anti-FABP 9F3的浓度分别为1.55 mg/mL与1.48 mg/mL。5.夹心荧光免疫分析AMI早期标志物肌红蛋白与心型脂肪酸结合蛋白本文研究了一种新颖的基于超顺磁性蛋白微球的夹心荧光免疫分析法,成功实现对AMI早期标志物Myo与H-FABP的分析。我们利用亲和素修饰的的超顺磁性蛋白微球为载体,结合生物素-亲和素的高度亲和力与免疫分析的特异性实现快速、高效的检测分析物。与传统的分析法相比该种分析方法检测灵敏度高、试剂用量少、分析时间短、检测限低、操作简单,而且不需要大型贵重的仪器。60min-75min内能顺利完成样品的分析;抗原用量仅为10μL就可以完成检测工作;样品的检测范围分别是0-30 ng/mL(H-FABP)和0-200 ng/mL(Myo),检测限分别为10ng/mL(Myo)和1 ng/mL(H-FABP)。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
第一章文献综述  13-36
  1.1 磁性纳米颗粒概述  13-18
    1.1.1 纳米、纳米材料、纳米技术  13
    1.1.2 磁性氧化铁纳米颗粒的制备研究现状  13-16
    1.1.3 氧化铁磁性纳米颗粒的表面修饰  16-18
    1.1.4 磁性纳米颗粒在生物医学中的应用  18
  1.2 磁性微球概述  18-22
    1.2.1 磁性微球分类  18-19
    1.2.2 生物医学用磁性微球特性  19-20
    1.2.3 磁性微球的主要制备方法  20-21
    1.2.4 磁性微球在生物医学领域的应用  21-22
  1.3 免疫磁珠概述  22-29
    1.3.1 概念、结构和性质  22-23
    1.3.2 免疫磁珠制备  23
    1.3.3 微球的致敏方式  23-25
    1.3.4 免疫磁珠应用  25-29
  1.4 生物素-亲和素系统简介  29-35
    1.4.1 BAS 系统的反应原理  29-30
    1.4.2 BAS 系统的特点  30-31
    1.4.3 BAS 系统的应用  31-35
  1.5 急性心肌梗塞(AMI)  35-36
第二章超顺磁性纳米颗粒的制备与表征  36-41
  2.1 材料和方法  36-37
    2.1.1 材料  36
    2.1.2 方法  36-37
  2.2 实验结果与分析  37-39
    2.2.1 γ-Fe_20_3 纳米粒子X 射线衍射分析  37-38
    2.2.2 透射电子显微镜（TEM）分析  38
    2.2.3 γ-Fe_20_3 纳米颗粒红外光谱表征分析  38-39
    2.2.4 磁性能表征结果分析  39
  2.3 讨论  39-40
    2.3.1 磁性纳米颗粒的制备  39-40
    2.3.2 马弗炉煅烧Fe_3O_4 法制备γ-Fe_20_3 纳米颗粒  40
  2.4 小结  40-41
第三章白蛋白超顺磁性微球的制备与表征  41-47
  3.1 材料和方法  41-43
    3.1.1 材料  41
    3.1.2 实验方法  41-43
  3.2 结果与分析  43-46
    3.2.1 HSA /γ-Fe_20_3 微球扫描电子显微镜（SEM）表征  43
    3.2.2 原子力显微镜（AFM）表征分析  43
    3.2.3 透射电子显微镜（TEM）表征分析  43-44
    3.2.4 FT-IR 光谱分析  44
    3.2.5 铁元素浓度测定  44-45
    3.2.6 磁性能测试结果  45
    3.2.7 磁响应性能测定  45-46
  3.3 讨论  46
  3.4 小结  46-47
第四章超顺磁性蛋白微球的亲和素修饰  47-51
  4.1 材料和方法  47-48
    4.1.1 材料  47
    4.1.2 方法  47-48
  4.2 结果与分析  48-49
  4.3 讨论  49-50
    4.3.1 Avidin 修饰HSA/γ-Fe_20_3 微球  49-50
    4.3.2 Avidin 与蛋白磁微球结合量的检测  50
  4.4 小结  50-51
第五章超顺磁珠基的夹心荧光免疫分析  51-63
  5.1 材料和方法  51-54
    5.1.1 材料  51
    5.1.2 方法  51-54
  5.2 结果与分析  54-60
    5.2.1 生物素结合量测定  54-55
    5.2.2 荧光标记抗体的浓度测定  55
    5.2.3 免疫反应参数优化  55-56
    5.2.4 特异性分析  56
    5.2.5 荧光光谱（RLU）和光稳定性实验  56-58
    5.2.6 免疫分析结果  58-60
  5.3 讨论  60-62
    5.3.1 捕获抗体Anti-FABP10E1  60
    5.3.2 IMBs 及其制备  60-61
    5.3.3 磁珠基的夹心免疫分析  61-62
  5.4 小结  62-63
    5.4.1 免疫磁珠的制备  62
    5.4.2 检测抗体的荧光标记  62
    5.4.3 磁珠基的夹心荧光免疫分析  62-63
结论  63-64
参考文献  64-73
致谢  73-74
作者简介  74

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