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环境激素中邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二环己酯的免疫分析方法研究

作　者: 盛亚丽
导　师: 张明翠
学　校: 安徽师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 邻苯二甲酸二乙酯邻苯二甲酸二环己酯环境激素抗原抗体酶联免疫分析荧光免疫分析
分类号: O657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

邻苯二甲酸酯作为增塑剂被广泛地使用于工业生产和塑料制品中,因此它们很容易积累在水体和陆地上,成为全球性最普遍的污染物之一,广泛存在于大气、水体、土壤、生物体等自然环境中。邻苯二甲酸酯是一类重要的环境激素,能进入动物体内产生类似雌性激素的作用,对动物生殖和发育相关的正常激素的合成、分泌、贮存、体内运输、结合及清除等过程产生阻止作用,干扰血液中激素正常水平的维持,从而影响动物生殖发育,具有致癌性、致畸性和致突变性。经文献调研发现,有关免疫分析方法测定环境激素物质的研究具有很大的发展前景,有待进一步研究。为此,本文研究的目标是建立测定环境激素类邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二环己酯的免疫分析新方法。围绕这一目标,主要进行了以下研究工作:一、用合成的4-氨基邻苯二甲酸二乙酯和4-氨基邻苯二甲酸二环己酯通过重氮化的方法与牛血清蛋白结合形成全抗原,用全抗原免疫新西兰大白兔,在兔体内产生大量高效价的抗血清,通过双向琼脂扩散法和间接荧光免疫法检测抗体效价。双向琼脂扩散法效价达1 : 32,间接荧光免疫法检测抗体效价达1 : 25600。再进行兔颈部采血、离心分离、饱和硫酸铵盐析、纯化,得到邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二环己酯多克隆抗体IgG,-20℃低温保存备用。二、建立了邻苯二甲酸二环己酯抗原包被间接酶联免疫竞争法和间接荧光免疫竞争法。这两种方法方法灵敏度高,选择性好,线性范围宽。酶联免疫测定法邻苯二甲酸二环己酯的线性范围为0.2^-100μg L^-1,最小检出限是0.02μg L^-1,结构类似的邻苯二甲酸酯类化合物的交叉反应率小于10%。荧光检测邻苯二甲酸二环己酯,以异硫氰酸荧光素为荧光探针,在优化条件下,线性范围为0.1-200μg L^-1,最低检出限为0.05μg L^-1,交叉反应率小于10%。用这两种方法测定四种水样（自来水、湖水、长江水和饮料瓶沥出液）中的邻苯二甲酸二环己酯,结果令人满意。三、建立了邻苯二甲酸二乙酯抗体包被间接酶联免疫竞争分析法。该方法灵敏度高,选择性好,线性范围为0.2-400μg L^-1,最低检测限为0.08μg L^-1,交叉反应率小于10%。四种水样检测得到的结果令人满意,酶联免疫法适用于监测水样中的邻苯二甲酸二乙酯。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章绪论  13-26
  1.1 课题研究背景  13-16
    1.1.1 环境问题的提出  13-14
    1.1.2 环境激素对人体健康的危害  14-16
  1.2 邻苯二甲酸酯  16-19
    1.2.1 邻苯二甲酸酯的性质  17-18
    1.2.2 邻苯二甲酸酯的使用  18-19
  1.3 邻苯二甲酸酯在环境中的污染  19-22
    1.3.1 邻苯二甲酸酯对大气的污染  19
    1.3.2 邻苯二甲酸酯对水体的污染  19-21
    1.3.3 邻苯二甲酸酯对土壤的污染  21-22
  1.4 邻苯二甲酸酯监测-免疫分析方法  22-25
    1.4.1 免疫分析方法简介  22-23
    1.4.2 酶免疫分析法  23
    1.4.3 荧光免疫分析法  23-24
    1.4.4 化学发光免疫分析法  24
    1.4.5 电化学免疫分析法  24
    1.4.6 放射性免疫分析  24-25
  1.5 课题的研究设想  25-26
第二章两种邻苯二甲酸酯抗原的制备及表征  26-33
  2.1 引言  26-28
  2.2 实验材料和仪器  28
  2.3 实验方法  28-29
  2.4 抗原的表征  29-31
  2.5 抗原的合成结果与讨论  31
  2.6 小结  31-33
第三章抗体的制备及特性分析  33-49
  3.1 引言  33-34
  3.2 实验器材  34-35
  3.3 实验方法  35-42
    3.3.1 免疫方案  35-37
    3.3.2 琼脂双扩散实验测定抗体效价  37-39
      3.3.2.1 琼脂板的制备  38
      3.3.2.2 抗体效价测定  38-39
    3.3.3 间接荧光免疫法测定抗血清效价  39-40
      3.3.3.1 间接荧光免疫法实验条件的建立  39
      3.3.3.2 抗体效价测定  39-40
    3.3.4 抗血清的分离和提纯  40-42
      3.3.4.1 原理  40-41
      3.3.4.2 溶液配制  41
      3.3.4.3 抗体的分离  41-42
      3.3.4.4 抗体的提纯  42
  3.4 结果与讨论  42-48
    3.4.1 抗原的免疫剂量  42-43
    3.4.2 抗体效价的测定  43-45
    3.4.3 抗体的产生过程  45-47
    3.4.4 抗体的特异性  47-48
  3.5 小结  48-49
第四章抗原包被酶联免疫竞争法分析邻苯二甲酸二环己酯  49-63
  4.1 引言  49-52
    4.1.1 酶联免疫吸附分析  49
    4.1.2 直接法  49
    4.1.3 间接法  49-50
    4.1.4 竞争法  50-51
    4.1.5 双抗体夹心法  51-52
  4.2 材料和方法  52-54
    4.2.1 材料和试剂  52-53
    4.2.2 实验仪器  53-54
  4.3 抗原包被的间接竞争法流程  54-55
    4.3.1 抗原包被流程  54
    4.3.2 流程说明  54-55
  4.4 全抗原包被酶联免疫分析工作条件的选择  55-60
    4.4.1 抗原抗体浓度的选择  55-56
    4.4.2 PBST 缓冲溶液pH 的影响  56-57
    4.4.3 离子强度的影响  57-58
    4.4.4 温育温度和时间的影响  58-59
    4.4.5 标准曲线  59-60
  4.5 交叉反应  60-61
  4.6 样品加标回收实验  61-62
  4.7 小结  62-63
第五章抗原包被荧光免疫竞争法分析邻苯二甲酸二环己酯  63-71
  5.1 引言  63
  5.2 材料和方法  63-65
    5.2.1 材料和试剂  63-64
    5.2.2 实验仪器  64-65
  5.3 抗原包被的间接竞争法流程  65
  5.4 抗原包被荧光免疫分析工作条件的选择  65-69
    5.4.1 包被液的选择  65-66
    5.4.2 包被液的选择荧光免疫分析的其它条件  66-69
      5.4.2.1 pH 值  66-67
      5.4.2.2 离子强度  67
      5.4.2.3 二抗稀释度  67-68
      5.4.2.4 温育温度和时间  68-69
    5.4.3 标准曲线  69
  5.5 交叉反应  69-70
  5.6 加标回收实验  70
  5.7 小结  70-71
第六章抗体包被酶联免疫分析邻苯二甲酸二乙酯  71-79
  6.1 材料和方法  71-72
    6.1.1 材料和试剂  71-72
    6.1.2 实验仪器  72
  6.2 抗体包被酶联免疫分析流程  72-73
  6.3 抗体包被荧光免疫分析工作条件的选择  73-77
    6.3.1 包被液浓度的选择  73-74
    6.3.2 pH 的影响  74
    6.3.3 离子强度的影响  74-75
    6.3.4 温育温度和时间的影响  75-76
    6.3.5 标准曲线  76-77
  6.4 交叉反应  77
  6.5 加标回收实验  77-78
  6.6 小结  78-79
第七章总结及下一步研究计划  79-81
  7.1 免疫分析  79
  7.2 免疫分析法的前景  79-80
  7.3 需要进一步研究的问题  80-81
参考文献  81-85
致谢  85-86
硕士期间发表及待发表论文情况  86

环境激素中邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二环己酯的免疫分析方法研究

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