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小麦顺式还原酮加双氧酶（TaARD）基因的特性分析与原核表达

作　者: 贾建光
导　师: 康振生
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 小麦条锈菌顺式还原酮加双氧酶实时定量PCR 原核表达
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

小麦条锈病是小麦生产上的一个重要病害,由担子菌亚门真菌条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起。国内外的研究和实践证明,选育并合理利用抗病品种是控制小麦条锈病最为安全、经济、有效的方法,而解析小麦抗条锈的分子机制则对抗病育种工作具有重要的理论指导意义。本实验室在前期的工作中,构建了受条锈菌生理小种CYR23侵染的小麦品种水源11的抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization)文库,并对文库中包含的2,606个阳性克隆全部提取质粒后测序,共得到2,167条高质量的ESTs,为研究小麦与条锈互作的分子机制奠定了基础。本研究在以抑制性差减杂交技术获得大量受小麦条锈菌诱导差异表达基因的基础上,从中分离出一个受条锈菌诱导的小麦新基因TaARD(Aci-reductone-dioxygenase),并对该基因进行了初步的生物信息学分析和转录水平的表达谱分析,揭示了该基因在小麦与条锈菌互作过程中的分子生物学的功能。本研究首次分离出小麦基因TaARD,包含一个597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,其氨基酸序列具有β-barrel保守结构域;氨基酸聚类分析表明,预测编码的多肽与大麦HvARD编码生成的氨基酸序列相似性高达99%,与水稻OsARD的同源性达到92%。通过设计特异引物,利用中国春缺四体系,将TaARD位于4A染色体上。Southern杂交结果显示且该基因至少有6个拷贝,为多基因家族。利用基因枪介导轰击洋葱表皮细胞的瞬时表达实验,共聚焦显微镜观察显示TaARD蛋白分布在细胞核和细胞质中。半定量RT-PCR结果显示,TaARD在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致,该基因无组织特异性。TaARD在小麦与条锈菌互作的亲和组合中呈上调表达,非亲和组合中下调表达。外源的茉莉酸甲酯可诱导其上调表达,而在水杨酸、乙烯、脱落酸处理后下调表达。TaARD的表达水平也可被高盐、伤害以及包括低温、PEG的环境刺激所抑制而下调。这些结果表明TaARD基因所在的甲硫氨酸循环在小麦对环境胁迫和条锈菌相互作用中发挥了作用。将TaARD定向克隆到原核表达载体pET-32a中,成功构建融合表达载体TaARD -pET-32a。将构建的载体转化宿主菌BL21(DE3),以最佳条件0.1 mmol/L IPTG 25?C诱导表达24 h,获得大量表达产物。经His-Trap HP亲和层析柱纯化,免疫家兔制备多克隆抗体,并对收集的抗体进行了纯化。琼脂双扩散和ELISA检测结果表明,制备的抗体具有较高的效价,并对融合表达的TaARD蛋白结合活性良好。Western杂交显示,TaARD蛋白抗体对融合表达的重组蛋白和小麦叶片中TaARD蛋白都有较强的特异性。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章文献综述  10-25
  1.1 小麦条锈病的危害及研究现状  10-12
    1.1.1 小麦条锈病的危害  10
    1.1.2 小麦条锈病的研究现状  10-12
  1.2 植物抗病基因研究进展  12-13
    1.2.1 植物抗病性机理  12
    1.2.2 植物抗病基因的克隆  12-13
    1.2.3 小麦抗病基因的克隆  13
  1.3 植物抗病基因介导的信号途径  13-14
  1.4 顺式还原酮加双氧酶基因的研究进展  14-20
    1.4.1 植物中S-腺苷甲硫氨酸的代谢途径  14-15
    1.4.2 植物中乙烯多胺的合成和重要作用  15
    1.4.3 甲硫氨酸循环意义与代谢途径  15-17
    1.4.4 顺式还原酮加双氧酶的研究进展  17-20
  1.5 生物信息学  20-21
    1.5.1 生物信息学的产生和发展  20
    1.5.2 生物信息学的应用  20-21
  1.6 抑制差减杂交法  21
  1.7 实时定量RT-PCR  21-23
    1.7.1 定量RT-PCR 的原理  21-22
    1.7.2 实时荧光定量反转录PCR  22-23
  1.8 瞬时表达技术  23
    1.8.1 瞬时表达技术的原理  23
    1.8.2 基因枪介导的瞬时表达  23
  1.9 研究的目的及意义  23-25
第二章材料与方法  25-43
  2.1 材料、试剂及仪器  25-26
    2.1.1 材料  25
    2.1.2 试剂  25-26
    2.1.3 仪器  26
  2.2 实验方法  26-43
    2.2.1 小麦顺式还原酮加双氧酶基因Ta-ARD 开放阅读框的克隆  26-29
    2.2.2 小麦叶片基因组DNA 提取  29-30
    2.2.3 染色体定位  30
    2.2.4 Southern blot  30-33
    2.2.5 表达特征分析  33-36
    2.2.6 瞬时表达与亚细胞定位  36-37
    2.2.7 Ta-ARD 原核表达与纯化  37-40
    2.2.8 多克隆抗体的制备、检测与纯化  40-42
    2.2.9 Western 杂交  42-43
第三章结果与讨论  43-56
  3.1 实验结果  43-53
    3.1.1 Ta-ARD 开放阅读框的克隆  43-44
    3.1.2 小麦顺式还原酮加双氧酶基因TaARD 序列分析  44-47
    3.1.3 TaARD 基因的染色体定位与Southern 杂交  47
    3.1.4 小麦叶片总RNA 的提取  47
    3.1.5 半定量RT-PCR 分析  47-48
    3.1.6 实时定量PCR 分析  48-50
    3.1.7 TaARD 基因的原核表达与纯化  50-52
    3.1.8 抗血清的免疫学性质分析  52
    3.1.9 抗体的纯化及特异性检测  52
    3.1.10 TaARD 亚细胞定位  52-53
  3.2 讨论  53-56
第四章结论  56-57
参考文献  57-64
附录1  64-67
附录2  67-68
致谢  68-69
作者简介  69

小麦顺式还原酮加双氧酶（TaARD）基因的特性分析与原核表达

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