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梨抗病基因同源类似物及其全长的克隆与分析

作　者: 张洪磊
导　师: 王跃进
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 梨 梨黑星病 NBS-LRR 抗病基因同源类似物 抗病基因
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究从杜梨(Pyrus betulaefolia)、白梨(P. bretschneideri)、西洋梨(P. communis)、秋子梨(P. ussriensis)、沙梨(P. pyrifolia)、新疆梨(P. sinkiangensis)和杂交种(P. hybrid)等7个种内选取46个主要栽培品种为实验试材,利用根据已知抗病基因的NBS(nucleotide binding site)保守结构域设计的引物,通过PCR技术展开分离梨抗病基因同源类似物(resistance gene analogs, RGAs)的研究。对获得的阳性克隆进行序列测定,通过生物信息学分析,鉴定并筛选RGAs。在此基础上,利用RACE(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术获得部分RGAs的全长cDNA序列,并通过生物信息学分析、Southern blot分析、梨黑星病菌诱导的表达分析等,考察其结构特点、拷贝数以及在抗黑星病过程中的表现等。本研究取得的成果主要有:1、梨属植物RGAs的克隆及分析从39个梨树品种中克隆获得了102个RGAs,GenBank登录号分别为:FJ262736和EU939772～EU939872。在102个RGAs中,因RGAs Pb-Dshs-1(GenBank登录号:EU939772)和Pb-Zsm-2(GenBank登录号:EU939785)推导的氨基酸序列因不具连续的开放阅读框(open reading frame, ORF),所以没有进行进一步的分析。其余100个RGAs的均能推导为具有连续ORF的氨基酸序列,并具有抗病相关的NBS功能域,如P-loop、Kinase2、Kinase3和疏水结构(GLPLAL)等基序。同源性分析表明这100个RGAs核苷酸序列的同源性在2%～100%之间,氨基酸序列的同源性在20%～100%。利用Clustal X和MEGA 4构建的系统发育进化树表明,这100个RGAs聚类为两大类,其中有93个属于TIR(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)类,其余7个RGAs属于non-TIR类。Blast分析表明,本研究得到的梨RGAs与其它植物中已克隆的RGAs具有较高的同源性,与已知NBS类抗病基因也存在一定的同源性。本研究在梨的7个种内各选择1～4个RGAs检测其在RNA水平上的表达情况,共选出15个RGAs,根据其DNA序列设计特异PCR引物,通过RT-PCR检测到只有白梨、杜梨、秋子梨和杂交梨等4个种的8个RGAs在RNA水平上表达,其GenBank登录号分别为:FJ173825～FJ173829和FJ377558～FJ377561,而在西洋梨、新疆梨和沙梨中选择的7个RGAs均未检测到表达信号。2、早酥梨3个RGAs基因全长序列的克隆与分析根据早酥梨RGAs的cDNA序列,利用RACE技术获得了3个RGAs的基因全长cDNA序列。根据早酥梨RGAs Pb-Zs1获得的cDNA序列全长3498bp,包含一个3162bp的开放阅读框架,编码1053个氨基酸残基,分子量为120.3 kD,将该基因命名为Prg1,GenBank登录号为FJ943460。早酥梨Prg2基因全长为2384bp,包含一个完整的2325bp的ORF,编码774个氨基酸残基,分子量为88.8 kDa,GenBank登录号为FJ943461。早酥梨Prg1和Prg2基因核酸序列的同源性达91.9%,推测其可能为同一家族的基因。早酥梨RGAs Pb-Zs3基因的全长cDNA序列大小为1200bp,包含一个完整的921bp的ORF,其中起始密码子ATG位于175-177bp处,终止密码子TGA位于1093-1095bp,共编码306个氨基酸。分子质量为34.6 kD,命名为Vnp1(GenBank登录号为FJ763188)。生物信息学分析表明,Prg1和Vnp1基因都含有完整的抗病基因的NBS保守结构域和所有的基序P-Loop、Kinase2、Kinase3及疏水结构(GLPLA);早酥梨Prg1和Prg2基因含有与抗病相关的TIR和LRR结构域。同源性比对显示,Vnp1基因与蓖麻中克隆得到的烟草抗花叶病毒基因N类似蛋白,毛果杨TIR-NBS-LRR类抗病蛋白等具有较高的同源性;Prg1与Prg2基因编码的蛋白与从山荆子、拟南芥等中分离得到的TIR-NBS-LRR类抗病蛋白具有较高的同源性。另外,Prg1、Prg2和Vnp1基因与已克隆的西红柿的抗落叶病蛋白I2C-1、亚麻抗锈病基因L6和烟草抗花叶病毒N等NBS-LRR类抗病基也具有一定的同源性。3、梨黑星病菌诱导的早酥梨Prg1、Prg2和Vnp1基因的表达分析应用半定量RT-PCR技术,对早酥梨Prg1、Prg2和Vnp1基因在接种黑星病菌后的早酥梨叶片中的表达水平变化情况进行分析。结果表明:早酥梨Prg1基因的表达水平在接种黑星病菌后呈先升后降的趋势。接种黑星病菌后该基因表达水平呈明显上升趋势,在24小时后表达量达到最高点,随后又呈逐渐下降趋势,到72小时又降至未接种黑星病菌时的表达水平;早酥梨Prg2基因的表达量在接种黑星病菌后呈先降后升趋势。接种病菌后该基因表达水平迅速下降,在接种后12小时,观测到该基因的表达水平降至最低点,随后又呈现上升趋势,在接种黑星病菌48小时超过接种前的表达水平,随接种时间的增长又呈现下降趋势,在接种病菌72小时后,恢复至原来的表达水平。早酥梨Vnp1基因的表达量在接种黑星病菌216小时的范围内一直呈现上升趋势。梨黑星病菌诱导的早酥梨Prg1、Prg2和Vnp1基因的表达分析说明在早酥梨抗黑星病的过程中,早酥梨Prg1、Prg2和Vnp1基因在转录水平即受到调节,参与抗病反应。4、早酥梨Prg1基因的Southern blot分析将早酥梨基因组DNA分别用限制性内切酶EcoRⅠ,HindⅢ和XbaⅠ进行单酶切,将杜梨基因组DNA以EcoRⅠ酶切,以早酥梨Prg1基因制备探针,进行Southern blot。在HindⅢ酶切的早酥梨基因组DNA中最多检测到4个杂交信号,另外,在EcoRⅠ酶切的杜梨基因组DNA中也检测到2个杂交信号。Southern blot分析表明Prg1基因是以多拷贝的形式在梨属植物中广泛存在的。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章 文献综述  11-24
  1.1 梨主要病害概述  11-14
    1.1.1 梨黑星病  11-13
    1.1.2 其它主要病害  13-14
  1.2 植物抗病反应的分子机理  14-16
    1.2.1 基因对基因假说  14
    1.2.2 病原的无毒基因  14-15
    1.2.3 植物的防卫反应  15
    1.2.4 植物的防卫基因  15-16
  1.3 植物的抗病基因  16-21
    1.3.1 抗病基因的克隆方法  16-18
    1.3.2 抗病基因的结构特点  18-21
  1.4 植物抗病基因同源类似物  21-23
    1.4.1 抗病基因同源类似物与抗病基因的关系  21-22
    1.4.2 抗病基因同源类似物的研究现状及应用  22-23
  1.5 本研究的目的意义  23-24
第二章 材料与方法  24-39
  2.1 材料  24-25
    2.1.1 植物材料  24
    2.1.2 梨黑星病菌  24
    2.1.3 主要试剂与仪器  24-25
  2.2 方法  25-39
    2.2.1 梨叶片基因组DNA 的提取  25-26
    2.2.2 梨叶片总RNA 的提取及纯化  26-27
    2.2.3 梨抗病基因同源类似物的DNA 序列克隆  27-29
    2.2.4 梨抗病基因同源类似物的cDNA 序列克隆  29-31
    2.2.5 早酥梨抗病基因同源类似物全长Prg1、Prg2 和Vnp1 基因的克隆  31-34
    2.2.6 核酸及蛋白序列的生物信息学分析  34
    2.2.7 早酥梨Prg1、Prg2 和Vnp1 基因的表达的半定量RT-PCR 分析  34-35
    2.2.8 早酥梨Prg1 基因的的Southern blot 分析  35-39
第三章 结果与分析  39-65
  3.1 梨属植物抗病基因同源类似物的克隆及分析  39-52
    3.1.1 梨属植物抗病基因同源类似物的DNA 克隆及鉴定  39-42
    3.1.2 梨属植物抗病基因同源类似物的cDNA 克隆及鉴定  42-44
    3.1.3 梨属植物抗病基因同源类似物的聚类分析  44-51
    3.1.4 梨属植物抗病基因同源类似物的同源性比对  51-52
  3.2 早酥梨抗病基因同源类似物全长VNP1 基因的克隆及分析  52-56
    3.2.1 早酥梨Vnp1 基因的克隆  52-53
    3.2.2 早酥梨Vnp1 基因的生物信息学分析  53-55
    3.2.3 梨黑星病菌诱导的早酥梨Vnp1 基因的表达分析  55-56
  3.3 早酥梨抗病基因同源类似物全长PRG1 和PRG2 基因的克隆及分析  56-65
    3.3.1 早酥梨Prg1 和Prg2 基因的克隆  56-57
    3.3.2 早酥梨Prg1 和Prg2 基因的生物信息学分析  57-62
    3.3.3 梨黑星病菌诱导的早酥梨Prg1 和Prg2 的表达分析  62-64
    3.3.4 早酥梨Prg1 基因的Southern blot 分析  64-65
第四章 讨论  65-69
  4.1 梨属植物抗病基因同源类似物的克隆  65
  4.2 梨属植物抗病基因同源类似物的特征  65-66
  4.3 梨属植物抗病基因同源类似物的表达  66-67
  4.4 抗病基因同源类似物全长基因的克隆  67-68
  4.5 早酥梨PRG1、PRG2 和VNP1 基因在梨黑星病诱导后的反应  68-69
第五章 结论  69-71
参考文献  71-77
致谢  77-78
作者简介  78

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类 > 梨
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