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一种抗菌多肽的毕赤酵母表达的初步研究

作　者: 孙睿华
导　师: 钟建江；黄青山
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物工程
关键词: 抗菌肽毕赤酵母聚合酶链式反应高效液相色谱杀菌活性溶血活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

上海高科联合生物技术有限公司设计合成的抗菌肽GK8具有良好的杀菌活性,前期已人工合成了一定量的纯品,同时对GK系列抗菌肽也进行了大肠杆菌的融合表达。这为本文开展GK8毕赤酵母表达系统的研究创造了条件。选用的巴氏毕赤酵母不但具有原核生物易培养、操作便利等特点,又具有真核生物蛋白翻译后加工的能力;同时具有高表达、高稳定和高分泌等优点。其表达质粒属于分泌型,便于提取和纯化。本研究在由上海生工生物工程有限公司订购的质粒pUC57-GK8和设计的引物P1、P2的基础上,以pUC57-GK8质粒DNA为模板,通过PCR扩增鉴定该质粒的可靠性。将含有pUC57-GK8质粒大肠杆菌DH5α进行大量表达。经质粒提取、酶切鉴定筛选出阳性克隆用于构建重组质粒pPIC9K-GK8。重组质粒pPIC9K-GK8电转化到毕赤酵母中,通过G418筛选和双酶切鉴定选择转化了pPIC9K-GK8的毕赤酵母菌株进行诱导表达,收集毕赤酵母分泌表达的目标产物GK8。通过SDS-PAGE电泳和对金黄色葡萄球菌的杀菌活性初步检测,筛选高表达菌株。对有较高目标产物GK8表达的转化pPIC9K-GK8的毕赤酵母菌株进行扩增表达,并对发酵液进行了纯化分析和生物学活性检测。实验结果显示有目标产物GK8表达。通过纯化使其纯度大于95%。表达产物GK8的生物学活性和人工合成GK8相似,明显优于Cecropin。以上工作为进一步筛选高表达菌株,摸索大规模发酵及纯化工艺打下了一定基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
符号说明  10-11
前言  11
第一章文献回顾  11-29
  一、毕赤酵母表达系统研究现状  11-19
    1、常用表达菌株及表达载体  12-15
    2、基因整合及表达调控的机理  15-16
    3、巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养  16-19
    4、应用前景及展望  19
  二、抗菌肽研究现状  19-25
    1、抗菌肽的分类  20-21
    2、抗菌肽的作用及机理  21-23
    3、抗菌肽基因工程进展  23-24
    4、抗菌肽的应用前景  24-25
  三、抗菌肽GK8 研究现状  25-26
  四、小分子蛋白质电泳技术  26
  五、液相色谱技术  26-29
第二章实验材料与方法  29-43
  一、实验材料  29-35
  二、实验方法  35-43
    1、pUC57-GK8 的扩增及确认  35-36
    2、表达载体pPIC9K－GK8 的构建和筛选  36-38
    3、表达载体pPIC9K-GK8 的毕赤酵母表达及筛选  38-41
    4、pPIC9K-GK8 转化毕赤酵母的大量表达及纯化和生物学活性检测  41-43
第三章实验结果  43-49
  一、pPIC9K 和pUC57-GK8 的鉴定  43-44
  二、重组质粒pPIC9K-GK8 的鉴定  44-45
  三、构建pPIC9K-GK8 毕赤酵母菌株表达产物鉴定  45-46
  四、构建pPIC9K-GK8 毕赤酵母菌株表达产物的纯化及检测  46-47
  五、构建pPIC9K-GK8 毕赤酵母菌株表达产物的生物学活性检测  47-49
第四章讨论  49-56
  一、实验整体流程  49
  二、有关表达质粒构建  49-50
  三、有关毕赤酵母表达系统发酵条件  50-53
  四、有关小分子多肽的SDS-PAGE  53-54
  五、酵母表达菌株表达量的筛选  54-55
  六、有关表达产物GK8 的纯化  55
  七、有关所筛选重组菌株的情况  55-56
小结  56-57
参考文献  57-61
致谢  61-62
攻读学位期间发表学术论文目录  62-65
上海交通大学学位论文答辩决议书  65

一种抗菌多肽的毕赤酵母表达的初步研究

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