学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

VAP-33蛋白在DC及DCS细胞中的表达及功能研究

作　者: 杨振丽
导　师: 刘玉琴
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 病理与病理生理学
关键词: VAP-33 GLUT-4 小鼠树突状细胞肉瘤 pECFP-N1 肿瘤侵袭转移
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 8次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

我们实验室以前建立的小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞系,经过不同时期不同方法(形态、免疫组化、表达基因组芯片)的不断验证[李存玺、zhou shixin],确立了其为DC细胞的起源。利用其不同转移能力的克隆找到了在高转移亚系中高表达的一系列基因。其中包含VAP-33。我们还利用DCS细胞制备了兔多抗,经纯化后得到了DCS细胞特异的抗体。90年代我们实验室用自制的DCS多克隆抗体,通过Western Blotting方法鉴定出该抗体针对DCS细胞全蛋白在分子量为32kDa左右处有一特异性条带,并且电镜结果显示该蛋白表达在细胞膜上;本论文进一步提取DCS细胞膜蛋白,利用该抗体进行IP,从沉淀蛋白所跑SDS-PAGE胶上,切取32kDa左右的蛋白条带进行质谱分析,所得肽段蛋白序列输入NCBI Blast,与其序列匹配度最高的为VAP-33。由此,深入开展了VAP-33在DC及DCS细胞中的表达和功能研究,以期明确其在肿瘤侵袭转移中的作用。本论文分为两部分。第一部分中,重点观察VAP-33在DCS细胞及DC细胞中的表达及功能。首先,我们用免疫组化、Western blotting等方法对DC细胞及DCS细胞中VAP-33的表达进行了研究。最初我们提取DCS细胞的膜蛋白采用质谱技术检测到DCS细胞膜蛋白中有VAP-33的表达;又利用免疫组化的方法再次证实DC细胞及DCS细胞表达VAP-33;Western blotting结果显示VAP-33在DCS细胞不同肺转移能力的克隆细胞株(DD1＞DCS＞DG6)中也有表达,并随肺转移能力的不同而不同,在肺高转移的DD1细胞中VAP-33表达最高。其次,为了进一步验证VAP-33在肿瘤侵袭转移及肿瘤细胞体外成瘤能力中的作用,我们通过Tanswell、克隆形成率等方法,研究经VAP-33单抗封闭48h后的DCS细胞在穿膜能力、克隆形成能力方面的变化。Tanswell方法观察到,VAP-33抗体封闭后的穿膜细胞较空白组及同型对照组都少(p＜0.01),说明VAP-33与细胞侵袭转移能力有关系;克隆形成率检测该蛋白与细胞体外成瘤能力没有明显关系(p＞0.05),说明VAP-33与细胞的增殖无关。由于DCS细胞来源于DC细胞,而DC细胞又是重要的抗原递呈细胞,因此,除了上述对VAP-33与肿瘤侵袭转移关系的研究,我们还对大分子抗原刺激后的DCS细胞在形态、功能改变等方面进行了研究,其中特别关注了VAP-33的表达变化。倒置显微镜下观察到随抗原剂量的增加,细胞分支增多变长,细胞更铺展,趋向成熟DC的形态;Western blotting结果显示VAP-33的表达随抗原量的增加及抗原刺激时间的延长而降低;共聚焦显微镜观察到VAP-33在细胞胞浆中的表达更加分散、均匀。我们预期的结果是随抗原量的增加或抗原刺激时间的延长,VAP-33的表达会随之增加或者发生分布上的变化,与实际结果存在偏差。有研究显示,在胞浆中VAP-33与再循环内体(recycling endosomes,REs)的标志分子TfR(transferrinreceptor)有共定位,因此我们认为,DCS细胞在受到抗原刺激时,VAP-33通过再循环内体从核周的质膜不断地循环往复协助处理抗原。由此我们推断在该过程中VAP-33被消耗,或者消耗大于合成的速度,VAP-33有可能参与抗原处理。许多文献中报道了VAP-33参与GLUT-4囊泡转运,因此,我们也对两者在肿瘤细胞中的关系进行了初步探讨。血清饥饿后的DCS细胞经胰岛素刺激后,细胞膜中VAP-33及GLUT-4的分布发生变化。Western blotting检测结果显示两种蛋白量的变化不明显,而共聚焦显微镜结果显示细胞膜上VAP-33和GLUT-4共表达增加。这一结果需进一步利用强迫过表达VAP-33的实验体系进行重复验证。因此我们开展了下一部分的工作。第二部分中,为了更好的研究VAP-33在肿瘤侵袭转移中的作用,我们构建了表达VAP-33 CFP融合蛋白的表达载体。根据Gene Bank中VAP-33的mRNA序列(从起始密码子到终止密码子的前一个密码子,长726bp)设计一对引物,在正反引物的5’端分别加入XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位点及保护碱基。通过RT-PCR技术从DCS细胞的cDNA中扩增VAP-33,利用基因重组技术,将VAP-33的目的基因克隆到pECFP-N1载体的XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点之间,构建重组载体,经测序该载体构建成功。为后续实验奠定了基础。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
VAP-33研究现状  9-12
第一部分 VAP-33在DCS细胞及DC细胞中的表达及功能研究  12-38
  摘要  12-13
  引言  13-14
  实验材料  14-18
    一、细胞系  14
    二、菌株  14
    三、抗体  14-15
    四、培养基及主要试剂  15
    五、主要储备液及工作液的配制  15-16
    六、主要耗材  16
    七、主要仪器  16-18
  实验方法  18-26
    一、细胞培养  18
    二、蛋白的提取  18-19
    三、免疫沉淀(IP)  19
    四、BCA法检测蛋白浓度  19-20
    五、Western Blotting  20-21
    六、质谱样品准备及结果搜索数据库  21-22
    七、间接免疫荧光  22
    八、石蜡组织切片间接免疫组织化学(VAP-33)  22-23
    九、体外侵袭实验——Transwell  23-24
    十、克隆形成率测定  24
    十一、伊红—苏木素染色(HE染色)  24
    十二、抗原刺激DCS细胞成熟  24-25
    十三、细胞吞噬能力检测  25
    十四、胰岛素诱导葡萄糖转运  25-26
  实验结果  26-35
    一、VAP-33蛋白在DCS细胞及DC细胞中的表达  26-28
      1、DCS膜蛋白免疫沉淀及Western Blotting结果:  26
      2、切取SDS-PAGE胶上32kDa左右条带,质谱分析结果:  26-27
      3、VAP-33在DCS细胞中的表达:  27
      4、VAP-33在具有不同转移潜能的肿瘤细胞(DCS、DD1、DG6)中的表达:  27-28
      5、VAP-33在淋巴结滤泡树突状细胞中的表达:  28
    二、VAP-33与DCS细胞体外侵袭转移及成瘤能力的关系  28-30
      1、VAP-33蛋白对DCS细胞侵袭转移能力的影响:  28-29
      2、VAP-33蛋白对DCS细胞体外成瘤能力的影响  29-30
    三、大分子抗原对DCS细胞功能的影响  30-33
      1、抗原刺激后DCS细胞的形态变化:  30-31
      2、抗原刺激后DCS细胞中Id-1的表达变化:  31-32
      3、抗原刺激后DCS细胞的吞噬能力的变化:  32
      4、抗原刺激后DCS细胞中VAP-33的表达变化  32-33
    四、VAP-33在GLUT-4运输中的作用  33-35
      1、经胰岛素诱导后DCS细胞中VAP-33蛋白的表达:  33-35
  讨论  35-37
  参考文献  37-38
第二部分 VAP-33基因的克隆与表达  38-57
  实验材料  38-42
    一、细胞系  38
    二、菌株  38
    三、质粒  38
    四、培养基及主要试剂  38-39
    五、目的基因序列及RT-PCR引物  39-40
    六、主要储备液及工作液的配制  40-41
    七、主要耗材  41
    八、主要仪器  41-42
  实验方法  42-51
    一、质粒转化、扩增  42
    二、质粒提取  42-43
    三、细胞总RNA的提取  43-44
    四、逆转录为cDNA的第一链  44-46
    五、聚合酶链式反应(PCR)  46
    六、琼脂糖凝胶电泳检测引物的特异性  46-47
    七、VAP-33基因的克隆与表达:  47-50
    八、质粒转染细胞  50-51
  实验结果  51-56
    一、VAP-33-pECFP-N1重组载体的构建  51-56
  讨论  56-57
小结  57-58
附录一  58-63
附录二  63-64
附录三  64-66
附录四  66-67
附录五  67-69
致谢  69-70
简历  70-71

VAP-33蛋白在DC及DCS细胞中的表达及功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文