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犬布鲁氏菌流行病学调查及其外膜蛋白Omp31原核表达与ELISA抗体检测方法研究

作　者: 赵焜
导　师: 范伟兴；姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬种布鲁氏菌 细菌分离 Omp31基因 原核表达 间接ELISA
分类号: S858.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


犬布鲁氏菌首次由美国学者Carmichael在1966年从200例流产的比格犬中分离得到的,此后日本、德国、巴西、墨西哥、阿根廷、美国、捷克和中国也相继报道了犬布鲁氏菌感染和病原分离的情况。此菌可引起狗的流产和小范围的人得布病,还可感染猴和兔。布病是重要的人畜共患病,近年来在国内人畜间感染率有上升趋势,犬布病在全国大部分省区都有不同程度的感染。本试验调查了我国部分地区的犬布鲁氏菌病流行情况,并通过对犬布鲁氏菌外膜蛋白基因Omp3l的表达,初步建立了犬布病血清间接ELISA检测方法。(1)犬布鲁氏菌流行病调查：本试验从城区、农区和牧区分别采集犬血清820份、全血10份和脾脏28份,血清分别用光滑型和粗糙型虎红平板凝集试验(RBT)进行初检,初检阳性血清用光滑型和粗糙型试管凝集试验(SAT)和间接酶联免疫试验(iELISA)检测；全血和脾脏进行病原分离鉴定。结果光滑型和粗糙型RBT阳性数分别为37份和9份,阳性率分别为4.5%和1.1%,光滑型和粗糙型SAT阳性数分别为27份和7份,阳性率分别为3.3%和0.85%,间接ELISA阳性数16份和阳性率为2.0%。从脾脏中分离到一株菌株,并通过生化试验、噬菌体分型及PCR鉴定,确认为一株犬种布鲁氏菌。(2)犬种布鲁氏菌外膜蛋白Omp31基因原核表达和鉴定：根据GenBank上提供的基因序列设计引物,利用PCR技术扩增犬种布鲁氏菌RM6／66标准株Omp31基因,连接到pGEM-T Easy载体上并测序,将该基因插入到pET-32a载体中成功构建原核表达载体pET-Omp31,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,经WesternBlot鉴定该蛋白能被犬布鲁氏菌阳性血清所识别。(3)重组蛋白pET-Omp31的纯化和犬布病血清ELISA检测方法初步建立：重组蛋白pET-Omp31经大量诱导表达,以包涵体形式存在,8mol／L尿素4℃过夜溶解包涵体,经镍离子柱纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚苯乙烯反应板,抗原的最适包被浓度为49μg/mL,血清最适稀释度为1：20；最适封闭液为5%脱脂奶粉,封闭时间为37℃1h,血清及二抗最佳反应时间确定为37℃30min；底物最佳反应时间为10min；统计学分析后确定阴阳性的临界值为0.32。该方法有很好的特异性,较好的批内及批间重复性。该方法与布鲁氏菌病间接ELISA试剂盒检测结果的阴阳性符合率分别达到76.9%和92.5%。该方法的建立为犬布鲁氏菌病诊断提供了一种比较实用的血清学检测方法。

全文目录


前言  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一篇 文献综述  11-23
  第一章 犬布鲁氏菌病研究进展  11-23
    1 病原学  11-13
    2 临床表现及病理变化  13-14
    3 国内外犬布病疫情  14-15
    4 犬布病流行特征  15-16
    5 诊断  16-19
    6 治疗  19
    7 预防  19-20
    参考文献  20-23
第二篇 试验研究  23-71
  第一章 部分地区犬布鲁氏菌病流行情况调查  23-37
    1 材料  24
    2 方法  24-28
      2.1 血清学检测方法  24-25
      2.2 分离培养  25
      2.3 种型鉴定  25-28
    3 结果  28-32
      3.1 血清学检测结果  28-30
      3.2 细菌分离培养及鉴定  30-32
    4 讨论  32-35
    参考文献  35-36
    英文摘要  36-37
  第二章 犬种布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因原核表达和鉴定  37-55
    1 材料  37-38
      1.1 菌种和载体  37
      1.2 主要试剂  37-38
      1.3 主要仪器  38
      1.4 主要溶液配方  38
    2 方法  38-46
      2.1 PCR扩增目的基因  38-39
      2.2 目的基因的克隆和筛选阳性重组子  39-42
      2.3 原核表达载体的构建  42-44
      2.4 重组质粒的诱导表达  44-45
      2.5 最佳诱导条件的确定  45
      2.6 表达产物的检测  45-46
    3 结果  46-50
      3.1 PCR扩增  46-47
      3.2 TA质粒构建及序列鉴定  47
      3.3 重组表达载体pET-Omp31的筛选与鉴定  47-48
      3.4 表达产物的SDS-PAGE电泳检测以及Western-blot分析  48-50
    4 讨论  50-53
    参考文献  53
    英文摘要  53-55
  第三章 重组蛋白的纯化和犬布病间接ELISA抗体检测方法的研究  55-71
    1 材料  55-56
      1.1 主要试剂及血清样品  55-56
      1.2 主要仪器设备  56
      1.3 用于蛋白纯化溶液的配制  56
      1.4 ELISA所用溶液  56
    2 方法  56-60
      2.1 重组蛋白的大量诱导表达  56
      2.2 目的蛋白存在情况检测  56
      2.3 镍柱的处理  56
      2.4 从包涵体中纯化目的蛋白  56-57
      2.5 纯化蛋白的浓缩  57
      2.6 重组蛋白浓度的测定及抗原性的测定  57-58
      2.7 重组蛋白间接ELISA检测方法的初步研究  58-60
    3 结果  60-65
      3.1 重组蛋白的制备及纯化  60-61
      3.2 重组蛋白浓度的计算及抗原性测定  61
      3.3 间接ELISA方法的建立  61-65
    4 讨论  65-68
    参考文献  68-69
    英文摘要  69-71
全文总结  71-73
附录  73-77
致谢  77

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 犬
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