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家蚕性肽受体基因的分子克隆及半定量分析

作　者: 华荣胜
导　师: 时连根
学　校: 浙江大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕交配后反应性肽受体半定量RT-PCR
分类号: S881
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

雌蚕蛾交配后会产生产卵数增加和对求偶异性的接受率下降的现象,即“交配后反应”。这种生理和行为方面的变化,是由存在于雄蚕蛾精液中的“交配因子”所诱发的,它在交配过程中传输给雌蚕蛾。1996年Ando等发现交配可以通过抑制PBAN(性外激素生物合成激活神经肽)的产生,来降低蚕醇(性外激素)的释放,从而达到引起家蚕“交配后反应”的目的。Fuyuki等于1999年发现,对雌蚕腹部的刺激以及其受精囊内具有活力的精子,可以抑制蚕醇的释放,推测其机理是：首先触觉刺激短暂地抑制PBAN神经元的活性,然后受精囊内有活力的精子长久地抑制PBAN神经元的活性。但家蚕中这种神经传递的途径并没有被探明,雌蚕受精囊内具有活力精子的持久作用即交配因子的机制也没有被探明。本实验根据昆虫性肽受体(SPR)功能保守性设计引物,从雌蚕受精囊中克隆出了SPR,并采用RT-PCR方法分析了其在相关组织中的表达情况,主要研究结果如下：1、从春华×秋实品种雌蚕蛾的受精囊中提取总RNA,反转录获得第一链cDNA。根据GeneBank中家蚕SPR的序列设计两个引物,正向引物(27bp):5’-CGTTGAATTGTCTATGGTGACCGCCAT-3’,反向引物(28 bp)：5’-TTAAAGCACAGTTTCGTTTGTACAGGTC-3’,对cDNA进行PCR扩增,克隆到家蚕性肽受体基因并测序。该基因cDNA全长1221 bp,含24.6%A、26.6%C、22.9%G和26%T,编码406个氨基酸。2、用Clustal W2软件比对家蚕(Bombyx mori) SPR基因序列与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、疟蚊(Anopheles gambiae)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura) SPR基因序列,结果显示家蚕(Bombyx mori) SPR基因与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)的SPR基因在进化树上的距离较近。氨基酸序列的比对结果显示,家蚕(Bombyx mori) SPR蛋白质序列与其他5种昆虫SPR蛋白质序列的同源性均在50%以上,6种昆虫SPR蛋白质序列的N端变化较大,同源性很低,属于多变区域；而C端同源性很高,可能属于功能保守区域。3、取不同时期(幼虫五龄期、蛹期和成虫期)家蚕睾丸、卵巢、神经系统、脂肪体、丝腺和受精囊6种组织样本,通过半定量RT-PCR方法分析了SPR基因在这6种组织中的表达情况,并综合比较了它们的表达变化。结果显示,在脂肪体和丝腺中的表达量相对较低；睾丸中的表达量起伏较大；卵巢、神经系统和受精囊中的表达量,与蛹期相比,交配前均有提高,交配后卵巢和神经系统中的有所下降,而受精囊中的则稍有上升。性肽的作用是通过受体来介导的,因此受体的表达与性肽的作用可能存在一定程度的时间与数量上的关系。本实验结果可以看出,卵巢、神经系统和受精囊是与性肽受体作用相关的组织,性肽可能作用于以上组织中的受体,受精囊中有活力的精子可以长久地抑制PBAN神经元的活性,受精囊中性肽可能也是持久引起“交配后反应”的因素之一。交配引起的触觉刺激可以短暂地抑制PBAN神经元的活性,交配前神经系统中SPR表达有较大提高,有可能是性肽作用于神经系统的受体,从而抑制PBAN的活性,交配后SPR表达的下降是与短暂抑制这一点相符合。交配引起的触觉刺激这一因素可能只是表象或者存在两种作用方式,这将有待于进一步的研究,同时卵巢在“交配后反应”中的作用也有待进一步的探索。本研究结果有助于更好地认识家蚕“交配后反应”,利用该受体的抑制剂的研究,促进其在昆虫生物防治方面的作用,同时为家蚕中其他的GPCR研究以及其他昆虫中的SPR研究提供借鉴经验。

全文目录

目录  4-7
致谢  7-8
中文摘要  8-10
第一篇文献综述  10-27
  第一章昆虫交配因子研究进展  11-18
    1. 昆虫交配因子的来源、类别及其相关作用  11-13
      1.1 肽类物质  11
      1.2 保幼激素及其类似物  11-12
      1.3 蜕皮激素及其类似物  12
      1.4 前列腺素(PG)  12
      1.5 雄性生殖腺分泌物质(Acps)所涉及的分类  12-13
    2. 交配因子在雌虫体内的传递路径、作用位点及其作用机制  13-14
      2.1 传递途径  13-14
      2.2 作用靶点  14
      2.3 作用机制  14
    3. 交配因子在模式生物果蝇中取得的进展  14-16
    4. 家蚕交配因子研究概况  16-18
  第二章 G蛋白偶联受体研究进展  18-27
    1. GPCR的特征和分类  18
    2. GPCR的活化模式  18-19
      2.1 二态模式  18-19
      2.2 多态模式  19
    3. GPCR的作用机制研究  19-20
    4. GPCR二聚化研究  20-22
      4.1 同源二聚化及其功能  20-21
      4.2 异源二聚化及其功能  21-22
    5. GPCR与药物研究  22-27
      5.1 GPCR突变及其相关疾病  23-24
      5.2 GPCR固有活性与新药开发  24-25
      5.3 孤儿GPCR与新药研发  25-27
第二篇实验研究  27-65
  第三章实验设计与方案  28-31
    1. 研究目的和意义  28-29
    2. 主要研究内容  29-31
      2.1 家蚕性肽受体基因的克隆及序列分析  29-30
      2.2 家蚕性肽受体基因的组织表达特性  30-31
  第四章家蚕性肽受体基因的克隆及其序列分析  31-44
    1. 实验材料  31-34
      1.1 家蚕  31
      1.2 试剂  31-34
      1.3 仪器  34
    2. 实验方法  34-39
      2.1 家蚕受精囊组织总RNA的提取  34-35
      2.2 总RNA的质量分析  35
      2.3 第一链cDNA合成  35-36
      2.4 PCR反应  36
      2.5 琼脂糖凝胶电泳及割胶回收目的条带  36-37
      2.6 连接  37
      2.7 转化及筛选  37
      2.8 提取质粒  37-38
      2.9 酶切回收,测序  38
      2.10 序列分析  38-39
    3. 结果与分析  39-42
      3.1 家蚕性肽受体基因的克隆  39
      3.2 家蚕性肽受体基因全序列测定  39-41
      3.3 家蚕性肽受体基因与其它物种SPR基因的序列比对分析  41-42
    4. 讨论  42-44
  第五章半定量RT-PCR技术分析家蚕性肽受体的组织表达特性  44-65
    1. 材料  44-45
      1.1 家蚕  44
      1.2 试剂  44-45
      1.3 仪器  45
    2. 实验方法  45-50
      2.1 内标基因的选择  45-46
      2.2 引物设计  46
      2.3 PCR最适反应条件的确立  46-48
      2.4 材料收集  48
      2.5 总RNA的提取  48
      2.6 总RNA的质量分析及第一链cDNA合成  48-49
      2.7 PCR反应  49-50
      2.8 琼脂糖凝胶电泳及数据处理  50
    3. 结果与分析  50-63
      3.1 PCR反应最适条件的确定  50-53
      3.2 家蚕不同发育时期卵巢中性肽受体基因表达情况  53-54
      3.3 家蚕不同发育时期睾丸中性肽受体基因表达情况  54-56
      3.4 家蚕不同发育时期神经系统中性肽受体基因表达情况  56-57
      3.5 家蚕不同发育时期脂肪体中性肽受体基因表达情况  57-59
      3.6 家蚕不同发育时期丝腺中性肽受体基因表达情况  59-61
      3.7 家蚕不同发育时期受精囊中性肽受体基因表达情况  61-62
      3.8 家蚕不同组织中性肽受体基因表达情况的比较  62-63
    4. 讨论  63-65
参考文献  65-73
英文摘要  73-75
攻读硕士期间发表的学术论文  75

家蚕性肽受体基因的分子克隆及半定量分析

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