学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

人RNP-70基因克隆与表达以及重级SSA和SSB的ELISA应用

作　者: 侯颖娜
导　师: 赵晓瑜；刘国振
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 自身免疫性疾病 ENA U1RNP-70 SSA SSB 克隆与表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 7次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


可提取性核抗原(Extractable nuclear antigen, ENA)是真核细胞的一类小核RNA与蛋白质复合物,主要包括RNP、Sm、SSA、SSB、Jo-1、Scl-70等,其抗体称之为抗ENA抗体,ENA多肽抗体是多种自身免疫性疾病的免疫学标志：抗U1-RNP抗体是混合性结缔组织病(MCTD)的标志性抗体,抗SSB抗体是干燥综合症(SS)和系统性红斑狼疮(SLE)等的标志性抗体。自身抗体对自身免疫性疾病的诊断具有重要的指导作用。目前,医院检测抗ENA多肽抗体的方法主要是酶联免疫吸附实验(ELISA),而实现这一目的需要制备高纯抗原。所以本实验的目的在于,应用基因工程方法获得性质单一、且具有免疫特异性的重组蛋白。本实验以人脑cDNA文库为模板,通过PCR获得U1RNP-70多肽的DNA片段,并定向克隆到MBP(麦芽糖结合蛋白)融合系统的载体pMALTM-c和pMALTM-c-2X中。阳性重组子经双酶切、PCR鉴定以及DNA序列测定获得了验证。SDS-PAGE显示,U1RNP-70融合蛋白得到高表达。通过亲和层析纯化后,Western-blotting和ELISA检测证明,该融合表达蛋白具有U1RNP-70的免疫原性和免疫特异性。用Factor Xa切割MBP-U1RNP-70得到单一的U1RNP-70抗原蛋白,再次经ELISA法检测,结果显示融合蛋白与非融合蛋白的抗原敏感性和特异性无明显差异,表明标签MBP对于融和蛋白的抗。原性影响不大。另外在本实验室前期工作的基础上,高效表达、纯化了可溶性融合蛋白SSA、SSB。SDS-PAGE证明SSA, SSB融合蛋白得到高表达。纯化后经Western-blotting和ELISA实验证明,表达蛋白分别具有SSA, SSB免疫原性和免疫特异性,其中SSB的免疫学特异性和敏感性与天然的生化制品相当。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
第1章 引言  9-18
  1.1 自身免疫性疾病及其诊断  9-10
  1.2 ENA的研究进展  10-15
    1.2.1 ENA的种类  10
    1.2.2 U1RNP-70的免疫学特性  10-14
    1.2.3 SSA的免疫学特性及分子组成  14
    1.2.4 SSB的免疫学特性  14-15
  1.3 PMAL载体系统的特点  15-16
  1.4 本研究的前期工作基础  16
  1.5 本研究的目的及意义  16-18
第一部分 U1RNP-70基因的克隆与表达  18-45
  第2章 材料与方法  18-29
    2.1 实验材料  18-21
      2.1.1 一般药品  18-19
      2.1.2 配制试剂  19-20
      2.1.3 标准分子量  20
      2.1.4 实验仪器  20-21
    2.2 实验方法  21-29
      2.2.1 U1RNP-70基因的获得  21-22
      2.2.2 构建测序载体及鉴定  22-24
      2.2.3 pMAL-c-U1RNP-70基因表达载体的构建  24-26
      2.2.4 U1RNP-70基因在大肠杆菌DH5α中的诱导表达及产物分析  26-29
  第3章 实验结果与讨论  29-45
    3.1 U1RNP-70基因的获得  29
    3.2 构建测序载体及鉴定  29-35
      3.2.1 蛋白酶K处理PCR扩增产物提高酶切效率  29-30
      3.2.2 U1RNP-70基因转化pGEM-T载体  30
      3.2.3 蓝白斑筛选  30-31
      3.2.4 质粒分子大小的鉴定  31
      3.2.5 重组子的PCR鉴定  31-32
      3.2.6 重组子的序列测定  32-35
    3.3 pMAL-c-UIRNP-70基因表达载体的构建  35-38
      3.3.1 U1RNP-70基因大肠杆菌表达系统载体的选择与构建  35-36
      3.3.2 U1RNP-70基因表达载体在大肠杆菌中的转化  36
      3.3.3 pMAL-c-U1RNP-70基因表达载体重组质粒的鉴定  36-38
    3.4 U1RNP-70基因在大肠杆菌中的诱导表达  38-40
      3.4.1 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检验  38-39
      3.4.2 U1RNP-70融合蛋白的纯化  39-40
    3.5 构建PMAL-c-2X-U1RNP-70表达载体  40-43
      3.5.1 换载体pMAL-c-2X  40
      3.5.2 pMAL-c-2X-U1RNP-70基因的诱导表达  40-41
      3.5.3 Factor Xa切割MBP-U1RNP-70  41-42
      3.5.4 pMAL-c-2X-U1RNP-70抗原性的鉴定(Western blotting)  42
      3.5.5 pMAL-c-2X-U1RNP-70抗原性的鉴定(ELISA法)  42-43
    3.6 讨论  43-45
第二部分 SSA、SSB重组菌的表达、纯化及ELISA检测  45-59
  第4章 材料与方法  45-47
    4.1 实验材料  45
    4.2 实验方法  45-47
      4.2.1 诱导表达重组菌SSA、SSB  45
      4.2.2 表达产物的纯化  45
      4.2.3 表达、纯化产物的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳  45
      4.2.4 表达、纯化产物的抗原特异性研究  45-47
  第5章 实验结果与讨论  47-52
    5.1 重组菌SSA、SSB的诱导、表达和纯化  47-48
      5.1.1 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检验  47-48
    5.2 重组菌SSA、SSB的抗原性的鉴定  48-51
      5.2.1 重组SSA、SSB抗原性的鉴定(Western blotting)  48-49
      5.2.2 重组SSA、SSB抗原性的鉴定(ELISA)  49-50
      5.2.3 Factor Xa切割MBP-SSA  50-51
    5.3 讨论  51-52
  第6章 结论  52-53
  参考文献  53-58
  硕士期间发表的论文  58-59
  致谢  59

相似论文

  1. 棉铃虫和烟夜蛾生殖生物学特性比较研究,S433
  2. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  3. 多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究,X172
  4. 氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达,X172
  5. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  6. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  7. 两个玉米转录因子ZmC4HC3和ZmNAC的克隆与表达分析,S513
  8. 植物天冬酰胺合成酶基因的抗病性调控功能分析,S511
  9. Toll样受体4在实验性自身免疫性葡萄膜炎发病中的作用,R773.9
  10. 日本三角涡虫热休克蛋白70的基因克隆与表达分析,Q78
  11. 艰难梭菌毒素B羧基末端膜受体结合蛋白基因的克隆和表达,Q78
  12. 纤维素降解真菌的筛选及其纤维素酶基因的克隆与表达,Q78
  13. 传染性软化病病毒（桐乡株）的nested RT-PCR检测及其RNA聚合酶的克隆和表达,S884
  14. 人RNP-70基因克隆与表达以及重组SSA和SSB的ELISA应用,R346
  15. 张兰教授治疗Graves病的经验总结,R259
  16. CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16、CX_3CL1在正常人和肝纤维化与肝硬化患者肝脏组织内的表达变化,R575.2
  17. 微波固态功率驱动模块及其关键技术研究,TN62
  18. 黄瓜显微结构及类黄酮和类胡萝卜素关键酶基因表达差异的初步研究,S642.2
  19. 白菜花发育相关基因BcNS的克隆、表达与功能分析,S634.3
  20. 75例干燥综合征的临床病例分析及SSA、SSB和SS56在SS患者唇腺组织中表达的研究,R593.2

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com