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Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶及其激活因子的功能鉴定

作　者: 孟晓蕾
导　师: 黄日波
学　校: 广西大学
专　业: 发酵工程
关键词: 1,3-丙二醇二醇脱水酶甘油脱水酶激活因子 Lactobacillus diolivorans
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

从天然菌L．diolivorans中纯化了二醇脱水酶。经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-PAGE电泳结果显示，该酶分子量约200kDa，由分子量分别为62kDa、35kDa、22kDa的三种亚基组成，酶相对三种主要底物的K_m值分别是，1，2-丙二醇1.3mmol／L，甘油5.8mmol／L，1，2-乙二醇10.3 mmol／L，酶对辅酶B₁₂的K_m值为1.5μmol／L，而辅酶B₁₂是酶催化活力必需的辅助因子。酶反应的最适pH为8.6，最适温度为37℃。以L．diolivorans基因组DNA为模板，PCR扩增得到了二醇脱水酶基因（gldCDE）及其激活因子基因（gldGH），分别构建了重组质粒pSE-gldCDE与pSE-gldGH，两外源基因均在E．coli BL21中得到表达。经SDS-PAGE分析表明，gldCDE基因的表达蛋白包括62kDa、35kDa、22kDa三个亚基，与其基因序列中的三个读码框相符，并与天然菌中纯化所得二醇脱水酶的蛋白质组成相同；gldGH基因的表达蛋白包括68kDa、13kDa两个亚基，与其基因序列中的两个读码框相符。gldGH基因的表达蛋白经金属鏊合亲和层析与凝胶过滤纯化后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中显示其分子量约325kDa，因此推测其很可能为大小两种亚基形成的α₄β₄多聚体。在进一步的酶功能鉴定中，重组菌中的二醇脱水酶基因表达产物不具备脱水酶活力，与丘状乳杆菌（Lactobacillus collinoides）二醇脱水酶基因在E．coli中的重组表达情况一致；纯化后的gldGH基因的重组表达产物，以天然菌中纯化得到的二醇脱水酶为对象，经酶功能检测后确认为二醇脱水酶激活因子。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-9
第一章前言  9-13
  1.1 1,3-丙二醇的工业应用和生产  9-10
  1.2 生物合成1,3-丙二醇的关键酶  10-11
  1.3 Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶及其激活因子的研究意义  11-13
第二章材料与方法  13-22
  2.1 材料  13-14
    2.1.1 菌株与质粒  13
    2.1.2 酶与试剂  13-14
    2.1.3 主要仪器设备  14
  2.2 方法与步骤  14-22
    2.2.1 L.diolivorans的培养  14-15
    2.2.2 酶的提取和纯化  15
      2.2.2.1 L.diolivorans二醇脱水酶的纯化  15
      2.2.2.1 gldGH表达产物的纯化  15
    2.2.3 酶活力的检测  15-16
      2.2.3.1 L.diolivorans二醇脱水酶活力的检测  15-16
      2.2.3.2 L.diolivorans二醇脱水酶激活因子活力的检测  16
    2.2.4 蛋白质浓度测定  16
    2.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  16-17
    2.2.6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  17-18
    2.2.7 L.diolivorans二醇脱水酶基因(gldCDE)与其激活因子基因(gldGH)的克隆表达  18-22
      2.2.7.1 L.diolivorans基因组DNA的制备  18
      2.2.7.2 gldCDE基因与gldGH基因的引物设计和PCR扩增  18-19
      2.2.7.3 大肠杆菌感受态的制备  19-20
      2.2.7.4 质粒DNA的小量制备  20-21
      2.2.7.6 连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞  21
      2.2.7.7 阳性克隆的筛选和酶切验证  21
      2.2.7.8 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达  21-22
第三章结果与分析  22-34
  3.1 天然菌中L.diolivorans二醇脱水酶的纯化与性质测定  22-26
    3.1.1 L.diolivorans二醇脱水酶的纯化  22-24
    3.1.2 二醇脱水酶的酶学特性  24-26
      3.1.2.1 pH值对酶反应活力的影响  24
      3.1.2.2 温度对酶反应活力的影响  24-25
      3.1.2.3 酶反应动力学  25-26
  3.2 L.diolivorans二醇脱水酶基因(gldCDE)的克隆表达  26-29
    3.2.1 二醇脱水酶基因(gldCDE)表达质粒的构建  26-28
    3.2.2 gldCDE基因的序列分析  28
    3.2.3 gldCDE基因表达产物的SDS-PAGE分析  28-29
    3.2.4 重组菌中二醇脱水酶活力的测定  29
  3.3 L.diolivorans二醇脱水酶激活因子基因(gldGH)的克隆表达  29-34
    3.3.1 用简并引物扩增gldGH基因全序列  29-30
    3.3.2 gldGH基因的全序列分析  30
    3.3.3 表达质粒pSE-gldGH的构建  30-32
    3.3.4 gldGH基因表达产物的PAGE分析  32
    3.3.5 gldGH基因表达产物的酶功能检验  32-34
第四章讨论  34-38
  4.1 L.diolivorans二醇脱水酶  34-35
  4.2 L.diolivorans二醇脱水酶激活因子  35-38
第五章结论与展望  38-40
  5.1 结论  38
  5.2 问题与展望  38-40
参考文献  40-45
附录  45-51
致谢  51-52
攻读学位期间发表论文情况  52

Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶及其激活因子的功能鉴定

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