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重金属Cd~(2+)对棕尾别麻蝇免疫的影响及抗菌基因筛选

作　者: 李艳敏
导　师: 叶恭银
学　校: 浙江大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 棕尾别麻蝇重金属血淋巴细胞免疫体液免疫包囊延展酚氧化酶溶菌酶超微结构电镜基因筛选序列分析
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文主要研究了重金属镉对棕尾别麻蝇血细胞的形态结构、血细胞数量、存活、延展、包囊以及血淋巴体液中酚氧化酶PO和溶菌酶LO的影响。同时对棕尾别麻蝇cDNA文库进行了抗菌肽基因的筛选,主要内容概括如下：1重金属Cd 2+对棕尾别麻蝇血细胞形态结构的影响光学显微镜下观察对照组和Cd 2+处理组血细胞的形态没有差别,处理组和对照组浆血细胞和颗粒血细胞仍能延展产生伪足。透射电镜下观察原血细胞、浆血细胞、颗粒血细胞和类绛色细胞的形态发生了一些变化：透射电镜下棕尾别麻蝇幼虫原血细胞胞质内可见一些电子密集的颗粒,并且偶尔可以见到原血细胞的细胞分裂,核内染色质分散,经过重金属Cd 2+处理的原血细胞细胞质浓缩,细胞膜内陷,核内染色质凝聚。经过重金属处理之后的浆血细胞核仁不明显,染色质凝聚,细胞质内充满大量的囊泡,囊泡内有些内含物,可能为重金属颗粒,细胞内膜系统紊乱,并且整个细胞有膨胀趋势。透射电镜下观察到对照组和处理组的颗粒血细胞差异不大,都具有少许颗粒等内含物,处理组的颗粒血细胞细胞膜裂口,内含物外漏。经Cd 2+处理后的类绛色细胞其胞质内细胞器明显减少,并在膜周边出现大量空囊泡。2重金属Cd2+对棕尾别麻蝇细胞数量、存活、延展以及包囊的影响经测定Cd 2+对棕尾别麻蝇的亚致死浓度LC25约为100μg/g, LC50约为150μg／g,用这两种浓度的Cd 2+分别处理棕尾别麻蝇幼虫,幼虫经Cd2+处理后血细胞总数与对照相比明显减少,对于血细胞延展而言,处理后72h和96h的血细胞在30min内的延展率与对照比没有差异,而在24 h、48 h和120 h时处理组的血细胞延展率有所降低,而培养3 h后经处理过的幼虫血细胞的延展率与对照比显著降低,经过Cd处理过的蛹活体包囊率与对照比明显降低,存在显著性差异,对幼虫及蛹期的活体包囊率也有一定的抑制作用,说明Cd离子对蛹期的包囊率有一定的抑制作用,对蛹血淋巴血细胞产生一定的毒害。3重金属Cd2+对棕尾别麻蝇体液中酚氧化酶PO和溶菌酶LO活性的影响幼虫经100μg/gCd2+和150μg/gCd2+处理后,随着处理时间的不同和处理浓度的不同,PO活性明显受到影响。在24 h和48 h高浓度的Cd 2+使PO活性增强,而在72 h和96 h随着Cd离子浓度升高,PO活性受到明显抑制,到了120h Cd 2+对PO活性的影响没有明显变化。结果表明Cd 2+对血淋巴LO活性明显有抑制作用,24h时随浓度升高,抑制作用显著增大,在其他时间段内经100μg/gCd2+和150μg/gCd2+处理后的LO活性与对照比都显著下降,而100μg/gCd2+和150μg/gCd2+处理之间没有显著差异。说明100μg／gCd2+和150μg/gCd2+对棕尾别麻蝇幼虫血淋巴的毒害作用差别不大。4棕尾别麻蝇cDNA文库抗菌肽基因的筛选采用基于cDNA表达文库的昆虫源抗菌肽基因的高效克隆筛选技术。对棕尾别麻蝇cDNA文库大批量的筛选和重复涂板验证后,得到一些有一定抑菌效果的阳性克隆。对其进行核苷酸测序,得到的核苷酸序列用BLASTn软件在GenBank非冗余核苷酸数据库和AMP数据库进行比对,从结果可以看出除了常见的杀菌作用的基因如：凝集素lectin,攻击素Attacin,丝氨酸蛋白酶抑制剂,几丁质酶等,还有一些没有报道过具有杀菌活性的基因如：昆虫角皮蛋白、细胞色素b、铁蛋白等。因此我们下一步的研究方向将是对这些新的基因进行抗菌活性的进一步验证。

全文目录

致谢  7-8
前言  8-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
目录  13-16
第一章重金属对昆虫免疫系统影响及解毒机理  16-32
  1 昆虫的免疫系统概述  16-25
    1.1 细胞免疫  17-19
    1.2 体液免疫  19-25
  2 重金属概述  25-26
    2.1 镉(Cd)  25-26
    2.2 铜(Cu)  26
  3 重金属对昆虫的毒性及解毒机理  26-32
    3.1 对昆虫生长发育的影响  27-28
    3.2 重金属对昆虫血细胞的影响  28-29
    3.3 昆虫对重金属的解毒机制  29-32
第二章重金属Cd~(2+)对棕尾别麻蝇血细胞形态结构的影响  32-40
  1 材料与方法  32-33
    1.1 供试昆虫  32
    1.2 光学显微镜下血细胞形态的观察  32-33
    1.3 透射电镜下血细胞形态的观察  33
  2 结果与分析  33-38
    2.1 原血细胞  34
    2.2 浆血细胞  34-35
    2.3 颗粒血细胞  35
    2.4 类绛色血细胞  35-38
  3 讨论  38-40
第三章重金属Cd~(2+)对棕尾别麻蝇细胞数量、存活、延展及包囊的影响  40-50
  1 材料与方法  41-43
    1.1 供试虫源  41
    1.2 试剂与仪器  41
    1.3 Cd~(2+)亚致死浓度(LC_(25))和致死中浓度(LC_(50))的测定  41
    1.4 Cd~(2+)对棕尾别麻蝇细胞数量、延展、存活及包囊的影响  41-43
    1.5 数据分析  43
  2 结果与分析  43-48
    2.1 Cd~(2+)亚致死浓度(LC_(25))的测定  43
    2.2 Cd~(2+)对棕尾别麻蝇细胞数量、延展、存活率等的影响  43-46
    2.3 Cd~(2+)对棕尾别麻蝇活体包囊率的影响  46-47
    2.4 Cd~(2+)对棕尾别麻蝇离体包囊率的影响  47-48
  3 讨论  48-50
第四章重金属Cd~(2+)对棕尾别麻蝇体液中酚氧化酶PO和溶菌酶LO活性的影响  50-57
  1 材料与方法  50-52
    1.1 虫源  50-51
    1.2 试剂与仪器  51
    1.3 Cd~(2+)处理  51
    1.4 血淋巴酚氧化酶(PO)活性测定  51
    1.5 溶菌酶(LO)活性测定  51-52
    1.6 抑菌圈实验法测定抗菌活性  52
    1.7 蛋白测定  52
    1.8 数据分析  52
  2 结果  52-55
    2.1 Cd~(2+)对棕尾别麻蝇血淋巴PO活性的影响  52-53
    2.2 Cd~(2+)对棕尾别麻蝇血淋巴LO活性的影响  53-54
    2.3 抑菌圈实验  54-55
  3 讨论  55-57
第五章重金属铜、镉对棕尾别麻蝇两种贮存蛋白亚基转录表达的影响  57-63
  1 材料与方法  57-59
    1.1 供试虫源  57
    1.2 研究方法  57-59
      1.2.1 重金属处理方法  57
      1.2.2 取样及样品总RNA抽提  57-58
      1.2.3 cDNA合成  58
      1.2.4 引物设计  58
      1.2.5 半定量RT-PCR体系及反应条件的确立  58-59
      1.2.6 贮存蛋白mRNA的半定量RT-PCR检测  59
  2 结果与分析  59-61
    2.1 Cu和Cd处理对棕尾别麻蝇芳基贮藏蛋白(BpAry)基因表达的影响  59-60
    2.2 Cu和Cd处理对棕尾别麻蝇幼虫血淋巴蛋白Ⅱ(LSP-2)基因表达的影响  60-61
  3 讨论  61-63
第六章棕尾别麻蝇cDNA文库抗菌肽基因的筛选  63-73
  1 材料  63-64
    1.1 供试cDNA文库和菌种  63-64
    1.2 试剂及其他材料  64
    1.3 培养基  64
  2 方法  64-68
    2.1 cDNA文库筛选及验证流程图  64-65
    2.2 cDNA文库的筛选  65-66
    2.3 阳性克隆涂板法验证  66-67
    2.4 抗菌活性验证  67
    2.5 序列分析  67-68
  3 结果与分析  68-72
    3.1 cDNA文库的筛选  68
    3.2 阳性克隆生长比较  68-70
    3.3 序列分析  70-72
  4 讨论  72-73
第七章总结  73-77
  1 对血细胞形态结构的影响  73
  2 重金属镉对棕尾别麻蝇细胞数量、存活、延展、包囊和体液中有关酶活性的影响  73-75
  3 抗菌基因筛选  75
  4 本研究的特色与创新点  75
  5 不足之处和今后研究的方向  75-77
参考文献  77-87

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