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绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌的获得及其在棉花中侵染过程研究

作　者: 赵凤轩
导　师: 戴小枫
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 野生棉 黄萎病 大丽轮枝菌 绿色荧光蛋白 侵染过程
分类号: S435.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


棉花黄萎病的病原菌是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),该病是维管束系统病害,是棉花生产上第一大病害,培育和种植抗病品种被认为是防治该病的有效途径之一。而筛选和鉴定棉花中潜在的抗源材料是选育抗病品种的基础。棉属野生种具有优良的抗病性状,显然挖掘野生棉种中潜在的抗病基因对抗病育种异常重要。要开展这一工作首先须明确各野生棉的是否是大丽轮枝菌的寄主,若为寄主,还需鉴定野生棉种的抗病反应类型,进而通过植物病理学方法研究大丽轮枝菌在抗感棉种中侵染的过程,揭示其固有的或诱导的组织结构抗病特性,为挖掘野生棉中潜在抗黄萎病基因和研究大丽轮枝菌的致病机理提供依据。采用蘸根接种法对8个野生棉的抗病类型进行了鉴定。结果表明,大丽轮枝菌均能侵染各野生棉种,在各棉种均能分离到病原菌,因此野生棉种是大丽轮枝菌的寄主。各野生棉种约在接菌10～14天后开始发病,呈现叶片萎蔫、褪绿和生长迟缓等症状,而感病对照军棉1号接菌8天后即产生叶片褪绿症状,13天后开始落叶,3周后棉株发病率达100%,抗病对照海7124也是在接菌8天后发病,症状以萎蔫和坏死为主,3周后植株的发病率为72%,主要表现为子叶黄化萎蔫。接菌6周后,病情指数和AUDPC最低的棉种是三裂棉,分别为13.33和25.56,且无棉株死亡;最高的是戴维逊棉,分别为88.33和256.93,植株死亡率达68.89%;感病对照军棉1号的病情指数和AUDPC分别为91.67和301.65,棉株死亡率达71.11%;抗病对照海7124分别为58.33和170.56,死亡率为6.67%。茎部组织大丽轮枝菌含量分析表明,三裂棉为51个/50 mg,戴维逊棉为331个/50 mg,感病对照军棉1号为871个/50 mg,抗病对照海7124为97个/50 mg。结合病症表型、病情指数和AUDPC等鉴定指标,将各棉种对大丽轮枝菌的抗性程度分为三类:高抗、抗病和感病。戴维逊棉为感病棉种;索马里棉、瑟伯氏棉、异常棉、长萼棉、旱地棉、澳洲棉为抗病棉种;三裂棉为高抗棉种。构建了含有构巢曲霉GPD启动子驱动的绿色荧光蛋白真菌表达载体pCH-sGFP,选择标记为潮霉素抗性基因Hyg。通过农杆菌介导法将真菌表达载体导入到大丽轮枝Vd991中,获得了208个具有绿色荧光信号的阳性转化子。根据菌落形态、生长速度、遗传稳定性和致病性实验筛选与野生型Vd991相似的转化子,其中Vd-gfp77转化子遗传稳定,致病能力和表型特征与Vd991相当,荧光信号强,可以用于组织侵染研究。研究了Vd-gfp77在不同抗病类型棉种中侵染过程的差异。侵入前阶段,大丽轮枝菌对抗病棉种和感病棉种的侵染无明显差异,分生孢子均能随机吸附在各棉种的根表面。侵入过程中,吸附在戴维逊棉根表面的孢子在接菌24h后开始萌发,接菌5天后,菌丝扩展到皮层,接菌7天后,菌丝侵入到维管组织,但仅限于个别导管,接菌14天后,棉株叶片已经产生萎蔫和褪绿症状,通过对其茎部检测,发现木质部内存在大量的菌丝,此时从重量为100mg的茎基部组织能分离到174个菌落。吸附在三裂棉根表面的孢子在接菌5天开始萌发,形成的菌丝主要从根冠区或者根部受损伤的区域开始侵入,在侵入过程中没有观察到附着胞,只是菌丝顶端表现的略微膨大,接菌7天后,菌丝扩展到皮层,接菌10天后,侵入维管组织,菌丝相互交织在一起沿着根纵轴方向生长,接菌14天后,三裂棉子叶呈现褪绿症状,真叶没有表现出任何发病症状,导管也没有褐化圈。此时,在三裂棉茎部维管组织观察到少数的菌丝,从重量为100mg的茎基部组织仅能分离到10个菌落,但在根尖顶端处仍能观察到大量的菌丝。结合大丽轮枝菌在三裂棉中侵染过程,棉株呈现的发病症状和茎基部大丽轮枝菌含量分析实验,推测大丽轮枝菌侵染三裂棉根部组织后,激活了与抗性相关的信号通路,诱导形成了以生理生化抗性为主的多种抗病反应相协调的机制,通过胼胝质、木质素和胶状物质的积累,提高了三裂棉的抗病能力,抑制了大丽轮枝菌在根部组织的扩展和繁殖。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章 绪论  15-24
  1.1 棉花黄萎病  15-16
    1.1.1 棉花黄萎病及其危害  15
    1.1.2 大丽轮枝菌的形态及寄主范围  15
    1.1.3 大丽轮枝菌的致病机理  15-16
  1.2 棉花大丽轮枝菌侵染过程研究进展  16-21
    1.2.1 侵入前阶段  16-17
    1.2.2 病原菌的侵入  17-19
    1.2.3 病原菌在寄主体内的扩展及症状形成  19-20
    1.2.4 寄主的的抗病反应  20-21
  1.3 棉属野生种在抗黄萎病育种中的应用  21
  1.4 绿色荧光蛋白在植物病原真菌侵染过程中的应用  21-22
    1.4.1 绿色荧光蛋白及其特点  21-22
    1.4.2 绿色荧光蛋白在植物病原真菌研究的应用状况  22
  1.5 研究的内容与研究意义  22-24
    1.5.1 主要内容  22-23
    1.5.2 课题研究的目的和意义  23-24
第二章 棉属野生种的抗病性鉴定  24-34
  2.1 材料  24
  2.2 方法  24-26
    2.2.1 野生棉对Vd991 的反应型鉴定  24
    2.2.2 野生棉种的抗病性鉴定  24-25
    2.2.3 病害的调查和统计  25-26
    2.2.4 棉种内Vd991 含量分析  26
  2.3 结果  26-32
    2.3.1 野生棉种对Vd991 反应型鉴定  26-27
    2.3.2 野生棉种的抗病性鉴定结果  27-30
    2.3.3 野生棉种的病情消长曲线  30-31
    2.3.4 野生棉种内病原菌含量分析  31-32
  2.4 讨论  32-34
第三章 绿色荧光蛋白真菌表达载体的构建  34-44
  3.1 材料  34-35
    3.1.1 菌株和质粒  34
    3.1.2 主要试剂  34
    3.1.3 主要培养基  34-35
    3.1.4 主要仪器  35
  3.2 方法  35-40
    3.2.1 DNA 重组技术  35
    3.2.2 sGFP 基因表达元件的扩增  35-36
    3.2.3 PCR 产物的T/A 连接、转化及鉴定  36-38
    3.2.4 pCH-sGFP 表达载体的构建  38-40
  3.3 结果  40-42
    3.3.1 sGFP 基因表达元件的扩增  40-41
    3.3.2 pGEM-sGFP 载体的构建  41
    3.3.3 pGEM-sGFP 和pCTHyg 载体的酶切  41-42
    3.3.4 真菌表达载体pCH-sGFP 的构建  42
    3.3.5 pCH-sGFP 载体阳性克隆的鉴定  42
  3.4 讨论  42-44
第四章 大丽轮枝菌Vd991 的遗传转化  44-56
  4.1 材料  44-45
    4.1.1 菌株和质粒  44
    4.1.2 主要试剂  44
    4.1.3 主要培养基  44-45
    4.1.4 主要仪器  45
  4.2 方法  45-48
    4.2.1 真菌表达载体转化农杆菌AGL-1  45
    4.2.2 大丽轮枝菌Vd991 的遗传转化  45-46
    4.2.3 转化子的筛选及单菌落分离  46
    4.2.4 转化子的鉴定与验证  46-47
    4.2.5 转化子表型鉴定  47-48
  4.3 结果  48-54
    4.3.1 真菌表达载体pCH-sGFP 和pCAM-gfp 转化农杆菌AGL-1  48-49
    4.3.2 大丽轮枝菌Vd991 的遗传转化  49-50
    4.3.3 转化子的筛选及单菌落分离  50
    4.3.4 转化子的分子验证  50-51
    4.3.5 大丽轮枝菌Vd991 转化子的荧光检测  51
    4.3.6 转化子菌落形态及生长速度的测定  51-52
    4.3.7 转化子遗传稳定性分析  52-53
    4.3.8 转化子致病力调查  53-54
  4.4 讨论  54-56
第五章 GFP 标记大丽轮枝菌Vd991 在不同棉种中侵染的研究  56-64
  5.1 材料  56
    5.1.1 供试材料与菌株  56
    5.1.2 主要试剂  56
    5.1.3 主要仪器  56
  5.2 方法  56-57
    5.2.1 供试材料的接种方法  56-57
    5.2.2 组织病理学切片的制备及显微观察  57
  5.3 结果  57-62
    5.3.1 GFP 标记的大丽轮枝菌在棉种中侵染的过程  57-60
    5.3.2 大丽轮枝菌在抗感棉种中侵染过程的差异  60-62
  5.4 讨论  62-64
第六章 全文结论  64-67
  6.1 主要结论  64-66
  6.2 后续工作  66-67
参考文献  67-73
附录  73-75
致谢  75-76
作者简历  76

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 纤维作物病虫害 > 棉病虫害
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