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山羊原始生殖细胞的分离培养

作　者: 熊浩
导　师: 王杏龙
学　校: 扬州大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 白山羊 胚胎干细胞 原始生殖细胞 分离培养
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)在一定条件下维持未分化状态,经过体外长期培养可以建立胚胎性干细胞系,称为胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells,EGCs),这是继胚胎癌细胞(Embryonal Carcinoma Cells, ECCs)和胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)之后发现的又一多能性干细胞。本研究以江苏本地白山羊胎儿的生殖嵴为实验材料,从PGCs中分离培养得到EGCs,对其进行体外传代和鉴定等,并且分析了影响山羊PGCs分离培养的一些因素,为本地白山羊ESCs系的建立奠定了一定的基础。实验结果如下:1.小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast cells,MEF),山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast cells,GEF)和小鼠睾丸支持细胞(Mouse sertoli cells,MSCs)三种细胞在体外生长行为基本相似,贴壁时间短,增殖迅速。试验发现以10μg/mL丝裂霉素-C处理3 h可以有效抑制GEF的增殖,适宜于饲养层的制作;在短期内冻存GEF可以置于-70℃保存,复苏率可以达到培养要求。2.原始生殖细胞在体外培养生长呈鸟巢状和集落状,凸起生长于成纤维细胞饲养层之上,传代后EGCs的形状与PGCs基本相似。3.以共培养,MEF和GEF作为饲养层的三种培养方式中:在培养基中没有添加细胞因子时,仅仅能够观察到原代集落;在培养基中添加10 ng/mL的LIF时,只有以GEF为饲养层才能将得到的原代集落传至二代,其它二种培养方式仅仅可以观察到原代集落。以MSCs为饲养层时,添加细胞因子与否均无法观察到原代集落。4.胎儿生殖嵴在室温(25℃)下消化15 min,使用0.125%胰酶+0.02%EDTA要比0.25%胰酶+0.04%EDTA效果好,前者消化得到的原代集落要多于后者,差异显著(P<0.05);试验比较了两种传代方法对山羊PGCs传代的影响,无论是“挑取集落法”还是“胰酶消化法”,均能将PGCs传至第二代,两种方法差异不显著(P>0.05)。5.在培养液中添加不同浓度和种类的因子:①LIF:10 ng/mL;②LIF:20 ng/mL;③LIF(10 ng/mL)+SCF(10 ng/mL);④LIF(20 ng/mL)+SCF(20 ng/mL),以GEF为饲养层,发现这四种培养方式对于原代集落形成率的差异是不显著的(P>0.05),且均能得到传至第二代的EGCs。6.不同胎龄胎儿分离培养PGCs的效果,结果发现4例冠臀长小于15 mm的胎儿仅观察到一个原代集落,6例大于30 mm的胎儿没有观察到原代集落。7.本试验对山羊第二代EGCs进行冷冻保存,复苏没有获得成功,复苏率为零。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
文献综述  11-28
  1. 哺乳动物胚胎干细胞的概念和特性  11-16
    1.1 哺乳动物胚胎干细胞的概念和来源  11-12
    1.2 哺乳动物胚胎干细胞的特性  12-14
    1.3 胚胎干细胞与胚胎生殖细胞  14-16
  2. 各种哺乳动物胚胎干细胞的研究进展  16-22
    2.1 小鼠胚胎干细胞的研究进展  16-20
    2.2 山羊胚胎干细胞的研究进展  20-22
  3 胚胎干细胞的鉴定  22-24
    3.1 形态学鉴定  22
    3.2 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性  22
    3.3 特异性标志分子的表达  22
    3.4 阶段特异性胚胎细胞表面抗原（SSEA）检测  22-23
    3.5 核型分析  23
    3.6 端粒酶活性检测  23
    3.7 嵌合体的制备  23
    3.8 体外分化实验  23-24
  4. 胚胎干细胞的应用和存在问题  24-28
    4.1 胚胎干细胞的应用前景和价值  24-27
    4.2 胚胎干细胞研究存在的问题  27-28
本研究的目的和意义  28-29
实验部分  29-64
  1. 材料与方法  29-39
    1.1 实验动物  29
    1.2 主要实验仪器  29
    1.3 主要试剂及其配制  29-33
    1.4 实验方法  33-39
  2. 结果与分析  39-50
    2.1 成纤维细胞  39-43
    2.2 山羊原始生殖细胞的生长行为  43-44
    2.3 不同饲养层对山羊原始生殖细胞分离培养的影响  44-45
    2.4 不同胰酶浓度的消化对原代集落的和传代的影响  45-46
    2.5 不同传代方式对传代的影响  46
    2.6 不同种类和浓度的细胞因子对PGCs 原代和传代的影响  46-47
    2.7 不同胎龄段山羊PGCs 培养的效果  47
    2.8 PGCs 的解冻与复苏  47-48
    2.9 PGCs 的鉴定（AKP 染色）  48-49
    2.10 体外分化实验  49-50
  3. 讨论  50-59
    3.1 成纤维细胞的培养  50-51
    3.2 丝裂霉素-C 对成纤维细胞的影响  51-52
    3.3 冻存对细胞活力的影响  52
    3.4 饲养层对山羊原始生殖细胞培养的影响  52-54
    3.5 不同细胞因子对培养山羊PGCs 的影响  54-55
    3.6 不同消化方式对PGCs 原代集落形成的影响  55-56
    3.7 不同传代方式对传代的影响  56-57
    3.8 不同胎龄的山羊胎儿对PGCs 培养的影响  57
    3.9. PGCs 的冻存复苏  57-58
    3.10 本次试验中影响PGCs 的其它原因分析  58-59
  4. 结论  59-60
  5 参考文献  60-64
致谢  64-65
攻读学位期间发表的学术论文  65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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