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利用反向遗传操作技术构建IBDV候选疫苗株的研究

作　者: 高立
导　师: 王笑梅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡传染性法氏囊病病毒 rGtHLJVP2 疫苗株 反向遗传操作技术
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


鸡传染性法囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)可引起雏鸡的急性、高度接触性、致死性传染病,即鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)。该病自从被发现以来,一直被养禽业所关注。疫苗的使用曾一度使该病得到较好的控制,但随着变异毒株(Variant IBDV)和超强毒株(Very virulent IBDV, vvIBDV)的出现,该病的防制变得严峻起来。疫苗免疫是防控vvIBDV的主要手段,但vvIBDV致病性很强且不适应细胞培养,活疫苗株的获得只能通过将野生vvIBDV在鸡胚或CEF细胞上传代致弱。这种传统的疫苗株驯化方法费时费力,而且结果带有随机性。对于高致病力的、易变异的vvIBDV的防控,特别是突发疫情的防控,开展新型疫苗株的构建研究十分必要。本研究通过流行病学调查分析,筛选到一株致死率高、抗原性出现漂变的亲本毒株HLJ0504。利用先分段扩增再融合全长的方法克隆了IBDV亲本毒株HLJ0504的全基因组并对其进行了测序。A、B节段长度分别为3260bp和2827bp, GenBank登陆号分别为GQ451330和GQ451331。软件分析发现,亲本毒株HLJ0504的VP2存在抗原漂变。遗传演化分析表明,亲本毒株A节段位于超强毒株分枝,而B节段在超强毒株和减毒株之间形成了1个独立分枝,是一株具有一定代表性的自然重组vvIBDV。为了研究IBDV新型疫苗株最适构建方案,本研究进行了疫苗株构建模式的筛选。首先以亲本毒株HLJ0504为骨架,突变了其主要保护性抗原VP2的两个氨基酸位点Q253H和A284T,拯救获得病毒rHLJ0504HT。rHLJ0504HT虽然能够适应细胞培养,但仍然具有较强的毒力。为了进一步降低其致病力,在rHLJ0504HT的基础上敲除IBDV的VP5蛋白,拯救出相应的病毒rHLJ0504HT△VP5。rHLJ0504HT△VP5对SPF鸡的毒力明显降低,但其在CEF细胞上的复制滴度不理想。为了获得高复制滴度、低致病力、遗传稳定、免疫效果良好的IBDV新型疫苗株,本研究突变了vvIBDV流行毒株HLJ0504的主要保护性抗原基因VP2的两个核苷酸位点(相应的氨基酸变化是Q253H和A284T),并将其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段,利用IBDV反向遗传操作系统,拯救并鉴定了重组病毒rGtHLJVP2。rGtHLJVP2具有如下生物学特点:1)良好的复制特性:在CEF细胞上与弱毒疫苗株Gt具有相似的复制动力学曲线,病毒滴度可达到107.3 TCID50/ml;在SPF鸡的法氏囊内,rGtHLJVP2与Gt也具有相当的病毒载量。2)对SPF鸡无致病性:接种SPF鸡后的14天内,试验鸡的精神状态良好,未出现任何发病症状,法氏囊无明显的病理变化。3)遗传稳定性良好:rGtHLJVP2在CEF细胞和SPF鸡上分别盲传20代和8代,病毒滴度保持稳定,引入突变位点未发生回复突变,毒力也没有返强。4)免疫原性良好:rGtHLJVP2免疫SPF鸡后,7d 80%血清抗体阳转,10d 100%阳转,而且能够100%保护不同株的强毒攻击。目前,市场上IBDV活疫苗包括弱毒活疫苗、中等或中等偏强毒力活疫苗两类。本研究分别以Gt、B87作为这两类疫苗的代表,进行了免疫效果的比较试验。研究发现:1)rGtHLJVP2免疫效果优于Gt弱毒苗,与B87中等毒力疫苗相当。rGtHLJVP2免疫组产生的抗体滴度和攻毒保护效果均与B87中等毒力疫苗差异不显著,但优于Gt弱毒疫苗免疫组。2)rGtHLJVP2安全性优于B87中等毒力疫苗。rGtHLJVP2免疫组和弱毒株Gt一样,免疫后不会造成SPF鸡及其法氏囊的病理损伤,但中等毒力疫苗B87却对法氏囊造成不可修复的病理损伤。本研究筛选到一株高致死率、抗原性出现漂变、有一定代表性的vvIBDV毒株HLJ0504。以其为研究材料,将其VP2基因进行双点突变(相应的氨基酸变化是Q253H和A284T),并替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段,利用IBDV反向遗传操作系统,拯救并鉴定了重组病毒rGtHLJVP2。该重组病毒复制滴度高、对SPF鸡无致病性、遗传稳定性和免疫效果良好、能保护不同株强毒攻击。而且rGtHLJVP2免疫效果优于市售的弱毒疫苗、安全性上优于中等毒力疫苗。rGtHLJVP2具备高效、安全、价廉、构建快速等特点,是一株良好的候选疫苗毒株。本研究为新型IBDV疫苗的进一步研发奠定了坚实的基础,对于IBDV突发疫情的应急防控具有重大意义。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-17
第一章 绪论  17-25
  1.1 IBDV 的结构和分子生物学  17-19
    1.1.1 IBDV 的形态和血清型  18
    1.1.2 IBDV 的基因组和编码蛋白  18-19
  1.2 IBD 的流行特点  19
  1.3 IBD 的防制  19-21
    1.3.1 IBD 的防控措施  19-20
    1.3.2 IBD 疫苗研究进展  20-21
  1.4 反向遗传技术在新型疫苗研究中的应用  21-23
  1.5 问题与展望  23-24
  1.6 本研究的目的和意义  24-25
第二章 亲本毒株筛选及其全基因组的克隆与序列分析  25-34
  摘要  25
  2.1 材料与方法  25-29
    2.1.1 病毒、鸡胚及试验动物  25-26
    2.1.2 主要试剂  26
    2.1.3 引物设计与合成  26
    2.1.4 病料处理  26
    2.1.5 病毒复状  26-27
    2.1.6 毒价的测定  27
    2.1.7 SPF 鸡致死率的测定  27
    2.1.8 IBDV VP2 抗原性预测分析  27
    2.1.9 IBDV 全基因组RNA 的提取  27
    2.1.10 IBDV 全基因组 RNA 的反转录  27-28
    2.1.11 IBDV 全基因组克隆  28
    2.1.12 IBDV 全基因组遗传演化分析  28-29
  2.2 结果  29-32
    2.2.1 ELD_(50)测定及致死率测定结果  29
    2.2.2 VP2 序列及抗原性分析  29
    2.2.3 全基因组扩增及测序  29-30
    2.2.4 全基因组遗传演化分析  30-32
  2.3 讨论  32-34
    2.3.1 亲本毒株的筛选  32-33
    2.3.2 HLJ0504 毒株是一株有代表性的自然重组病毒  33-34
第三章 IBDV 新型疫苗株构建模式的筛选  34-49
  摘要  34
  3.1 材料和方法  34-39
    3.1.1 质粒、细胞和单克隆抗体  34-35
    3.1.2 主要试剂  35-36
    3.1.3 引物设计与合成  36
    3.1.4 核酶结构的引入  36
    3.1.5 双点突变及VP5 缺失突变  36
    3.1.6 全基因组克隆的构建  36-37
    3.1.7 病毒拯救  37
    3.1.8 拯救病毒IFA 检测  37-38
    3.1.9 拯救病毒电镜观察  38
    3.1.10 拯救病毒RT-PCR 鉴定  38
    3.1.11 拯救病毒体外复制动力学研究  38
    3.1.12 拯救病毒毒力试验  38
    3.1.13 试验鸡法氏囊RT-PCR 与序列测定  38-39
    3.1.14 试验鸡血清抗体的检测  39
  3.2 结果  39-47
    3.2.1 感染性分子克隆的构建  39-40
    3.2.2 拯救病毒细胞病变  40
    3.2.3 拯救病毒IFA 检测  40-41
    3.2.4 电镜观察  41
    3.2.5 拯救病毒的 RT-PCR 检测  41
    3.2.6 拯救病毒体外复制动力学研究  41-42
    3.2.7 试验鸡症状及剖检变化  42-43
    3.2.8 试验鸡的囊重比与囊指数  43-44
    3.2.9 试验鸡法氏囊的组织病理变化  44
    3.2.10 试验鸡法氏囊的 RT-PCR 与序列测定  44-45
    3.2.11 试验鸡血清抗体的检测  45-47
  3.3 讨论  47-49
    3.3.1 HLJ0504 细胞嗜性的改变  47
    3.3.2 VP5 是毒力因子  47-48
    3.3.3 候选疫苗株应具备的特性  48-49
第四章 新型疫苗株的构建及其生物学性状测定  49-62
  摘要  49
  4.1 材料和方法  49-54
    4.1.1 病毒  49
    4.1.2 质粒  49-50
    4.1.3 细胞和单克隆抗体  50
    4.1.4 实验动物  50
    4.1.5 主要试剂  50
    4.1.6 引物设计与合成  50
    4.1.7 HLJ0504 株 VP2 基因替换 Gt 株基因组 VP2  50-52
    4.1.8 感染性分子克隆的构建  52
    4.1.9 病毒拯救  52
    4.1.10 拯救病毒IFA 检测  52
    4.1.11 拯救病毒电镜观察  52
    4.1.12 拯救病毒 RT-PCR 鉴定  52
    4.1.13 拯救病毒在CEF 细胞上的复制特性  52-53
    4.1.14 动物实验  53
    4.1.15 攻毒保护试验  53-54
    4.1.16 拯救病毒遗传稳定性试验  54
  4.2 结果  54-60
    4.2.1 VP2 修饰、替换与感染性分子克隆构建  54-55
    4.2.2 病毒拯救  55
    4.2.3 拯救病毒IFA 检测  55
    4.2.4 拯救病毒电镜观察  55-56
    4.2.5 拯救病毒RT-PCR 鉴定  56
    4.2.6 拯救病毒复制特性研究  56-57
    4.2.7 拯救病毒的致病性  57-58
    4.2.8 拯救病毒的免疫效果评价  58-59
    4.2.9 拯救病毒的遗传稳定性  59-60
  4.3 讨论  60-62
    4.3.1 重组病毒rGtHLJVP2 复制特性良好  60
    4.3.2 重组病毒rGtHLJVP2 对SPF 鸡无致病性  60
    4.3.3 重组病毒rGtHLJVP2 遗传稳定性良好  60-61
    4.3.4 重组病毒rGtHLJVP2 免疫原性良好  61-62
第五章 新型疫苗株免疫效果的评价  62-71
  摘要  62
  5.1 材料和方法  62-64
    5.1.1 病毒  62
    5.1.2 主要试剂  62
    5.1.3 试验分组与免疫  62-63
    5.1.4 血清抗体检测  63
    5.1.5 CD4+、CD8+淋巴细胞分离及检测  63
    5.1.6 疫苗株交叉保护性试验  63
    5.1.7 疫苗株致病力评估  63
    5.1.8 疫苗株在法氏囊中的载量检测  63-64
    5.1.9 试验鸡法氏囊RT-PCR与序列测定  64
  5.2 结果  64-69
    5.2.1 疫苗株免疫效果评价  64-65
    5.2.2 疫苗株免疫保护效果  65-66
    5.2.3 疫苗株的致病力比较  66-68
    5.2.4 试验鸡法氏囊病毒载量的检测  68-69
  5.3 讨论  69-71
    5.3.1 疫苗株体液免疫比较  69
    5.3.2 疫苗株 CD4+、CD8+T 淋巴细胞检测  69-70
    5.3.3 疫苗株免疫保护效果  70
    5.3.4 疫苗株的致病性研究  70-71
第六章 结论  71-72
参考文献  72-79
致谢  79-80
作者简历  80

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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