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重组人bFGF多克隆抗体的制备及在肿瘤检测方面的应用研究

作　者: 李星蓉
导　师: 王丽
学　校: 东北师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: bFGF 原核表达 多克隆抗体 ELISA 肿瘤检测
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是重要的血管生成因子之一,与肿瘤的发生发展密切相关。在本实验室已克隆bFGF基因基础上,本研究构建了带有6个His标签的bFGF原核表达质粒pET28a-bFGF,转入大肠杆菌中表达,发现bFGF蛋白以可溶和包涵体两种形式存在。通过对培养基、IPTG浓度、诱导时间、宿主菌的优化,将bFGF蛋白表达量提高至菌体总蛋白的30%上。使用Ni离子亲和层析方法纯化蛋白,蛋白纯度达到90%以上。利用纯化后的蛋白免疫家兔,经4次免疫获得了抗血清,抗体终效价达到1:819200。Protein G亲和纯化抗血清,利用纯化的bFGF多克隆抗体和商品化bFGF单克隆抗体,初步建立了bFGF夹心ELISA检测方法。对从医院采集的50名健康人和50名肿瘤患者的血清bFGF含量进行了检测。设定27pg/ml为cut-off值,发现肿瘤患者血清bFGF的阳性检出率(68%)明显高于健康人(10%),且两组检测数据差异具有显著统计学意义(P<0.01)。提示血清bFGF与肿瘤的发生、发展密切相关。本研究利用基因工程手段,制备了人重组bFGF蛋白和多克隆抗体,初步建立了检测bFGF的双抗体夹心ELISA方法,并将其应用于临床血清检测,为开发基于bFGF的肿瘤辅助诊断试剂奠定了基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一部分 引言  8-20
  一、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)研究进展  8-18
    (一) bFGF的基本性质  8-9
    (二) bFGF的生物学功能  9-10
    (三) bFGF的作用机制  10-11
    (四) bFGF与肿瘤  11-14
    (五) bFGF抗体的研制  14-16
    (六) bFGF的检测方法  16-18
  二、本课题的研究内容及意义  18-20
    (一) 研究内容  18
    (二) 课题意义  18-19
    (三) 技术路线  19-20
第二部分 实验材料与方法  20-41
  一、实验材料  20-26
    (一) 质粒、细菌菌株  20-21
    (二) 主要试剂  21-22
    (三) 重要试剂配制方法  22-25
    (四) 主要仪器  25-26
    (五) 实验动物  26
    (六) 人血清样品  26
  二、实验方法  26-41
    (一) 重组人bFGF原核表达载体的构建  26-31
    (二) 重组人bFGF蛋白的表达  31-34
    (三) 重组人bFGF蛋白的纯化  34-36
    (四) 兔抗重组人bFGF多克隆抗血清的制备  36-38
    (五) 抗血清的纯化  38-39
    (六) 多克隆抗体的特异性检测  39
    (七) 双抗体夹心ELISA检测bFGF方法的建立  39-40
    (八) 双抗体夹心ELISA检测肿瘤患者血清中bFGF含量  40-41
第三部分 结果与分析  41-63
  一、重组人bFGF原核表达载体的构建  41-43
  二、重组人bFGF蛋白表达与纯化  43-50
    (一) 重组人bFGF蛋白的表达  43-44
    (二) 最适表达条件的确定  44-48
    (三) 蛋白可溶性的确定  48
    (四) 蛋白的镍柱纯化  48-49
    (五) 蛋白的浓度测定  49-50
  三、兔抗重组人bFGF多克隆抗体的制备与纯化  50-57
    (一) 免疫方案  50
    (二) 抗体效价测试  50-55
    (三) bFGF 抗血清的纯化  55-56
    (四) 抗血清的特异性鉴定  56-57
  四、双抗体夹心检测bFGF含量方法的建立  57-59
    (一) 抗体最适工作浓度的确定  57-58
    (二) bFGF双抗夹心ELISA方法的基本参数  58-59
  五、双抗体夹心ELISA检测肿瘤患者血清中bFGF含量  59-63
    (一) 标准曲线的绘制  59
    (二) 健康人和肿瘤患者血清bFGF含量检测  59-63
第四部分 讨 论  63-67
  (一) 重组人bFGF原核表达载体的构建与鉴定  63-64
  (二) 重组人bFGF蛋白的表达与纯化  64-65
  (三) 兔抗重组人bFGF多克隆抗体的制备与纯化  65-66
  (四) bFGF 双抗体夹心ELISA检测方法的建立及肿瘤患者血清检测  66-67
结论  67-68
参考文献  68-73
致谢  73-74
在研期间公开发表论文情况  74
在研期间参加科研项目情况  74-75
附录  75

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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