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除虫链霉菌uhk01sav基因的功能研究

作　者: 何娟梅
导　师: 朱国强
学　校: 扬州大学
专　业: 微生物学
关键词: 除虫链霉菌负调节因子 uhk01sav基因寡霉素
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

链霉菌具有强大的次级代谢能力,能产生许多广泛应用于人、畜和农业的抗生素及其它生物活性物质。因此,开展链霉菌的抗生素生物合成的调控研究具有重要意义。我们前期研究发现,链霉菌模式菌--天蓝色链霉菌中uhk01基因(编码孤立组氨酸激酶)的缺失引起放线紫红素和十一烷基灵菌红素产量的大幅度增加,形态分化异常,如菌落呈现红色,气生菌丝和孢子产生减少。生物信息学分析显示,uhk01同源类似物广泛存在不同链霉菌中。本研究以重要工业用抗生素产生菌--除虫链霉菌为研究对象,通过基因缺失突变体的构建及交叉互补实验研究了uhk01同源基因(uhk01sav)的功能,并证实了uhk01和uhk01sav这两个同源基因的功能相似性。以除虫链霉菌NRRL8165为出发菌株,通过PCR-targeting系统成功构建其uhk01sav基因缺失突变体8165△uhk01sav。表型分析结果显示,uhk01sav基因的缺失可以使寡霉素A的产量提高5~6倍,达到2.153 g/L,突变体的生长速度变慢,产孢受阻。将uhk01sav基因重新导入突变体8165△uhk01sav,寡霉素产量及产孢均得到恢复,表明uhk01sav参与寡霉素生物合成的负调控,且与孢子形成密切相关。另外,我们利用Real-time RT-PCR技术对原始株和突变体中的3种重要抗生素(寡霉素、阿维菌素及戊内酯菌素)的生物合成基因进行了转录分析比较。结果表明,uhk01sav参与寡霉素生物合成的调控是由途径特异性调控基因所介导的。同时,uhk01的缺失还影响了另外2种重要抗生素--阿维菌素及戊内酯菌素的生物合成。将uhk01sav基因交叉互补至天蓝色链霉菌M145的uhk01缺失突变体,或将uhk01基因交叉互补至除虫链霉菌8165的uhk01sav缺失突变体,抗生素产生及孢子形成都恢复至相应野生型表型,证实了uhk01和uhk01sav的功能相似性。综上所述,uhk01及其同源类似物可能是链霉菌属中参与抗生素生物合成及形态分化发育的相对保守的重要调控基因,为我们对重要工业用链霉菌的代谢工程改造提供了很好的基因靶点。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
符号说明  9-10
文献综述  10-24
  1. 链霉菌的生长发育及进化树分析  10-14
  2. 除虫链霉菌基因组的研究进展  14-15
  3. 阿维菌素的生物合成及其调控的研究进展  15-19
  4. 寡霉素生物合成及其调控研究进展  19-21
  5. 戊内酯菌素生物合成及其调控研究进展  21-23
  6. 结束语  23-24
引言  24-25
1. 材料与方法  25-36
  1.1 材料  25-27
    1.1.1 菌株、质粒及引物  25-26
    1.1.2 培养基  26-27
    1.1.3 主要试剂和仪器  27
  1.2 uhk01sav 基因缺失cosmid 的构建  27-30
    1.2.1 uhk01sav 中断盒的扩增  29
    1.2.2 BW25113/pIJ790/cosmid7-41 的构建  29
    1.2.3 uhk01sav 缺失cosmid 的构建  29-30
  1.3 除虫链霉菌中uhk01sav 基因缺失突变体的构建  30-32
    1.3.1 接合转移实验  30
    1.3.2 突变体进行菌液PCR 验证  30
    1.3.3 Southern blot 验证  30-32
    1.3.4 划线收取uhk01sav 基因缺失突变体孢子  32
  1.4 uhk01sav 基因缺失突变体的表型观察  32-33
    1.4.1 uhk01sav 基因缺失突变体的电镜观察  32
    1.4.2 uhk01sav 基因缺失突变体的发酵及抗生素测定  32-33
  1.5 8165△uhk01sav 的互补实验  33-34
    1.5.1 互补载体的构建  33
    1.5.2 8165△uhk01sav 的交叉互补实验  33-34
    1.5.3 表型观察  34
    1.5.4 菌株发酵及抗生素测定  34
  1.6 天蓝色链霉菌M145△uhk01 突变体的交叉互补实验  34
  1.7 RNA 提取及real-time RT-PCR 分析  34-36
2. 结果  36-47
  2.1 除虫链霉菌uhk01sav 基因的序列分析  36
  2.2 uhk01sav 基因缺失突变体的构建及表型分析  36-40
    2.2.1 cosmid?uhk01sav 的构建  37-38
    2.2.2 8165?uhk01sav 突变体的构建及验证  38
    2.2.3 8165 和8165△uhk01sav 的电镜观察结果  38-39
    2.2.4 8165 和8165△uhk01sav 的抗生素产量比较  39-40
  2.3 8165△uhk01sav 的交叉互补实验及表型分析  40-43
    2.3.1 互补载体的构建  41
    2.3.2 互补菌株的验证  41-42
    2.3.3 互补菌株的表型分析和电镜观察  42-43
    2.3.4 互补菌株的抗生素测定  43
  2.4 M145△uhk01 的互补实验  43-44
  2.5 Real-time RT-PCR 分析比较原始株与突变体中3 种重要抗生素生物合成基因簇的转录差异  44-47
    2.5.1 RNA 定量和Tm 值优化结果  44-45
    2.5.2 uhk01sav 参与寡霉素生物合成的调控是由途径特异性调控因子介导的  45
    2.5.3 uhk01sav 还参与阿维菌素及戊内酯菌素生物合成的调控  45-47
3. 讨论  47-49
参考文献  49-53
致谢  53-54
攻读学位期间发表的学术论文目录  54

除虫链霉菌uhk01sav基因的功能研究

内容摘要

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