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阿维链霉菌聚酮体合成酶基因改造的研究

作　者: 李志平
导　师: 阎浩林
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 阿维菌素 依维菌素 寡霉素 聚酮体合成酶
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 9次
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内容摘要


利用组合生物学的原理，构建杂合的PKS modular 2基因，用以改造阿维菌素产生菌SY310的PKS modular 2基因。基因重组后希望得到能直接产生Ivermectin的工程菌。通过选择合适的酶切位点和载体，将含有milbemycin PKS modular 2 DH2-ER2的基因片段和3.6kb含有avermectin PKS modular 2 AT-DH-KR的基因片段进行组合，最终构建了含有杂合PKS modular2的温敏性接合转移质粒pLZ5。通过接合转移的方法将其向S. avermitilis SY310中转化，并通过一次、二次同源交换得到基因重组菌。在筛选得到的45个转化子中经过摇瓶发酵和HPLC检测后，发现32株不产次级代谢产物，10株仍产阿维菌素，其余3株产生了新的代谢产物，其结果有待进一步研究。阿维链霉菌发酵产生阿维菌素的同时，还产生另外一种聚酮化合物—寡霉素。寡霉素对哺乳动物、植物有很高的毒性。利用PCR的方法，以S. avermitilis SY310为模板，分别扩增得到了0.7kb olmA2基因片段和同样大小的olmA4基因片段，测序验证正确。利用合适的酶切位点和载体，将两个目的片段连接起来，最终构建了温敏性的olmA2～olmA4基因缺失载体pZL5。利用结合转移的方法，将其转入S.avermitilis SY310中，通过缺失载体和染色体之间的单、双同源交换，对染色体上长达70kb的寡霉素聚酮合酶(PKS)基因簇(olmA2～olmA4)进行了缺失。通筛选到的50株突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测，发现5株突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素，产量基本不变，说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成。突变株性状比较稳定，有一定的应用价值。

全文目录


中文摘要  10-11
英文摘要  11-12
英文缩写  12-13
前言  13-28
  1.阿维链霉菌研究概况  13
  2.阿维菌素和伊维菌素的应用及安全性  13-15
  3.阿维菌素的结构类似物和衍生物  15
  4.S.avermitilis基因组学  15-16
  5.阿维链霉菌生物合成的分子生物学研究进展  16-20
  6.寡霉素的概述及寡霉素PKS基因结构及生物合成  20-21
  7.组合生物合成在聚酮类抗生素中的应用  21-25
  8.论文的立题依据  25-27
  9.目的意义  27-28
实验材料  28-32
  1.菌种和质粒  28
  2.试剂  28-29
  3.溶液  29-30
  4.培养基  30-31
  5.仪器  31-32
实验方法  32-38
  1.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备  32
  2.大肠杆菌ET12567感受态细胞的制备  32
  3.热激转化和阳性克隆筛选  32
  4.PCR反应  32-33
  5.DNA电泳  33-34
  6.DNA酶切和连接  34
  7.载体的碱性磷酸化处理  34
  8.DNA测序  34
  9.菌株的活化  34
  10.链霉菌总DNA的提取  34-35
  11.链霉菌质粒DNA的提取(碱裂解法)  35
  12.重组质粒的接合转移  35-36
  13.阳性克隆菌株的筛选  36
  14.摇瓶液体发酵产物的提取  36-37
  15.5可维菌素、寡霉素和伊维菌素的检测及发酵单位的HPLC分析  37-38
结果与讨论  38-57
  第一部分 阿维菌素聚酮体合成霉基因的改造  38-46
    1.在基因文库Milbemycin PKS modular 2中筛选还原酶基因ER  38
    2.PCR扩增带有avermectin PKS modular 2中的AT-DH-KR基因  38
    3.克隆载体的构建  38-41
    4.重组质粒的转化  41-42
    5.基因重组菌株的获得  42-43
    6.发酵产物的检测  43-44
    7.取代变株的PCR验证  44
    8.结论  44-46
  第二部分 寡霉素合成阻断株的构建及发酵研究  46-57
    1.olmA2基因和olmA4基因的引物设计  46-47
    2.PCR反应  47-48
    3.PCR产物的测序的验证  48-49
    4.用于olmA基因缺失的重组质粒pZL5的构建  49-52
    5.接合转移试验  52
    6.基因重组菌株的获得  52-53
    7.发酵产物的检测  53-55
    8.稳定性考察  55
    9.缺失菌株的PCR验证  55
    10.讨论  55-57
结论  57-58
参考文献  58-62
致谢  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学
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