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2-吡咯酮衍生物HL-5201的合成及药理活性研究

作　者: 黄利
导　师: 雷林生
学　校: 南方医科大学
专　业: 药理学
关键词: 2-吡咯烷酮类衍生物 HL-5201 合成 抗炎 镇痛 免疫 肿瘤
分类号: R914.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：通过“一锅煮”多组分反应(MCRs)合成2-吡咯烷酮类衍生物HL-5201,并探讨HL-5201的抗炎免疫等相关药理活性。方法：1)以丁炔二酸二乙酯、环己胺、2-氨基吡啶和甲醛为原料,冰醋酸为催化剂,在乙醇溶剂中,采用“一锅煮”四组分反应合成2-吡咯烷酮类衍生物HL-5201,采用薄层色谱法(TLC)监测反应的进行,通过硅胶柱层析或重结晶法对粗产物进行分离纯化。通过质谱(MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)分析确认HL-5201的结构。通过改变不同组分的摩尔比、反应溶剂种类、投料方法和反应温度等条件,对反应条件进行优化。2)常规制备小鼠腹腔巨噬细胞,建立LPS (10μg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-a)等炎症因子实验模型。采用格里斯试剂(Griess)检测HL-5201对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响；通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测HL-5201对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、 IL-6和TNF-a的影响。评价HL-5201体外抗炎活性。采用二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀,建立小鼠急性炎症模型,观察HL-5201对小鼠耳廓肿胀度的影响,评价HL-5201的体内抗炎活性。3)采用醋酸诱导小鼠扭体反应和热板致痛实验模型,观察HL-5201的镇痛活性。4)常规制备小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠脾细胞,采用MTT法检测HL-5201对正常小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞的代谢活力的影响；并通过PI3K、P38MAPK、 JAK-2等信号通路阻断剂、蛋白酶体或基因转录抑制剂,研究HL-5201影响小鼠腹腔巨噬细胞代谢活力的可能作用机理。采用中性红法检测HL-5201对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。常规制备小鼠脾细胞,利用脂多糖(LPS,10μg/ml)或刀豆蛋白(Con A,4μg/ml)分别诱导小鼠脾细胞增殖,采用MTT法观察HL-5201对小鼠脾细胞增殖反应的影响。5)通过小鼠尾静脉注射印度墨汁,建立小鼠碳粒廓清实验模型,观察HL-5201对小鼠非特异性免疫功能的影响。以兔红细胞为抗原,豚鼠血清制作补体,建立小鼠体液免疫反应模型,检测HL-5201对小鼠血清溶血素水平的影响,评价HL-5201对小鼠体液免疫功能的影响。以二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应,并分离其脾脏和胸腺,观察HL-5201对小鼠耳廓肿胀度、脾脏指数和胸腺指数的影响,评价HL-5201对细胞免疫功能的影响。6)采用MTT法检测HL-5201对S180肿瘤细胞体外增殖的影响。抽取S180腹水,接种于小鼠前肢腋下,建立S180荷瘤小鼠动物模型,观察HL-5201对S180荷瘤小鼠肿瘤的影响。结果：1)合成反应在3h内完成,目标产物(HL-5201)以白色结晶或固体从溶剂中析出,采用硅胶柱层析法(流动相：正己烷：乙酸乙酯=6-1：1)或重结晶法可对产物进行分离纯化。产物经MS、1H-NMR和13C-NMR确证结构(化学名：N-(2-吡啶基)-4-环己氨基-5-氧代-2,5-二氢-3-吡咯甲酸乙酯)。通过对反应条件的优化,得到最佳反应条件(各组分摩尔比：丁炔二酸二乙酯：环己胺：2-氨基吡啶：甲醛：冰醋酸=1：1：1：3：2；溶剂：无水乙醇；投料方式：丁炔二酸二乙酯与环己胺在乙醇中预先反应10min,再加入2-氨基吡啶、甲醛与冰醋酸的混合液；反应温度：室温)。在该反应条件下,产率可达81.2%。2)LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎症因子(NO、IL-1β、 IL-6、TNF-α)实验中,与空白对照组相比,LPS(10μg/ml)能显著刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO、IL-1β、IL-6和TNF-α(P=0.000、P=0.000、P=0.000、P=0.000);与LPS组相比,HL-5201能有效抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO,浓度为60μmol/L时的抑制效果最佳(P=0.000),抑制率达到52.5%,与地塞米松(1μmol/L)相当。HL-5201能明显抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1β(P=0.000),在浓度为60μmol/L时,抑制率为60.9%。HL-5201在浓度为60μmol/L时明显抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6(P=0.004),抑制率为33.7%。相反,HL-5201在浓度为60、30μmol/L时,明显促进LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α,与LPS组比有显著性差异(P=0.000、P=0.000)。二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀试验中,HL-5201对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀无影响,与模型对照组相比无显著性差异。3)镇痛实验中,HL-5201对醋酸所致小鼠扭体反应次数和热板致痛实验中小鼠的痛阈值均无影响,与模型对照组比较无显著性差异。4)MTT法检测小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞代谢活力实验中,与空白对照组相比,HL-5201能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞代谢活力,且增强作用呈一定的剂量依赖关系,在浓度为30μmol/L时达到最大效应(P=0.000)。 H89(0.1μmol/L)、BAY11-7082(0.1μmol/L)和AG490(100μmol/L)对HL-5201(30μmol/L)促进小鼠巨噬细胞或脾细胞代谢活力无影响；ActinomycinD(0.1pg/ml)、Wortmannin(10μmol/L)、SB203580(10μmol/L)、 MG132(0.05μmol/L)、LY294002(5μmol/L)和Genistein (10μmol/L)能明显阻断HL-5201促进小鼠巨噬细胞或脾细胞代谢活力。HL-5201能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬中性红能力,与空白对照组相比有显著性差异(P值均小于0.01)。LPS或Con A诱导小鼠脾细胞增殖实验中,与空白对照组相比,LPS (10μg/ml)和Con A(4μg/ml)能显著刺激小鼠脾细胞增殖(P=0.000)；与LPS组或Con A组相比,HL-5201在浓度为60、30μmol/L时均能显著抑制LPS或Con A刺激小鼠脾细胞增殖反应(P=0.000、P=0.000)；当浓度降为15μmol/L以下时,HL-5201对LPS或Con A刺激小鼠脾细胞增殖反应的抑制效应消失,OD值接近LPS组或稍高。5)小鼠碳粒廓清实验中,HL-5201高剂量(100mg/kg)灌胃给药时能明显提高小鼠的校正吞噬指数,与空白对照组相比有显著性差异(P=0.010)。二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应实验中,HL-5201对小鼠耳廓肿胀度无影响,与模型对照组比较无显著性差异。血清溶血素实验中,HL-5201对小鼠血清溶血素水平无影响,与模型对照组无显著性差异。6)观察对肿瘤的影响实验中,HL-5201在浓度为7.5-60μmol/L时促进S180肿瘤细胞增殖,与空白对照组相比有显著性差异(P值均小于0.05)。与模型组相比,HL-5201高剂量(100mg/kg)灌胃给药时促进S180荷瘤小鼠的肿瘤的增长(P=0.016)。结论：1)以丁炔二酸二乙酯、环己胺、2-氨基吡啶和甲醛等原料通过多组分反应,经历多米诺氢胺化、aza-en类型反应和酰胺化-环化等过程合成了2-吡咯烷酮衍生物HL-5201,产物HL-5201可经硅胶柱层析(流动相：正己烷：乙酸乙酯=6～1：1)或重结晶法分离纯化。该法具有操作简单、反应条件温和、产率高等优点。2)HL-5201能有效抑制LPS刺激腹腔巨噬细胞产生NO、IL-1β和IL-6,对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀无抑制作用。提示HL-5201在体外有明显的抗炎活性,而在体内无抗炎活性。3)HL-5201对醋酸致小鼠扭体反应次数和热板致痛实验中小鼠痛阈值均无影响,提示HL-5201无镇痛活性。4)HL-5201能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞代谢活力,提示该化合物具有一定的免疫促进活性。HL-5201促进细胞代谢可能通过多环节作用,如通过激活PI3K、P38MAPK等信号通路或激活蛋白激酶等途径。HL-5201能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。HL-5201高浓度(60、30μmol/L)时均抑制LPS或Con A刺激小鼠脾细胞增殖反应,而低浓度(3.25～15μmol/L)对LPS或Con A刺激增殖反应却有稍微的促进作用,提示HL-5201高剂量可能具有免疫抑制活性,而在低剂量时却显示免疫促进活性,具体机制有待进一步深入研究。5)HL-5201在剂量为100mg/kg时能明显提高小鼠的校正吞噬指数；HL-5201对DNFB致小鼠耳廓肿胀和小鼠血清溶血素水平无影响。提示HL-5201能提高小鼠非特异性免疫功能,其机制可能与促进免疫细胞(如巨噬细胞或脾细胞)代谢活力有关,而对小鼠细胞免疫或体液免疫无影响。6)HL-5201体外促进S180细胞代谢或增殖,体内促进肿瘤的增长。此实验现象或与HL-5201促进细胞代谢或增殖活性相关,这一有趣的现象和具体机制有待进一步研究。

全文目录


摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
第一章 前言  16-32
  1 多组分反应在合成2-吡咯烷酮类衍生物中的应用  16-18
  2 2-吡咯烷酮类衍生物的生物活性  18-28
  3 参考文献  28-32
第二章 2-吡咯烷酮衍生物HL-5201的合成  32-38
  1 实验材料  32
  2 HL-5201合成方法  32-34
  3 实验结果与分析  34-37
  4 讨论  37
  5 结论  37
  6 参考文献  37-38
第三章 HL-5201抗炎活性研究  38-52
  1 实验材料  38-40
  2 实验方法  40-42
  3 统计分析  42-43
  4 实验结果  43-48
  5 讨论  48-50
  6 结论  50
  7 参考文献  50-52
第四章 HL-5201镇痛活性研究  52-58
  1 实验材料  52-53
  2 实验方法  53-54
  3 统计分析  54
  4 实验结果  54-56
  5 讨论  56-57
  6 结论  57
  7 参考文献  57-58
第五章 HL-5201免疫活性研究  58-82
  1 实验材料  58-60
  2 实验方法  60-66
  3 统计分析  66
  4 实验结果  66-76
  5 讨论  76-79
  6 结论  79-80
  7 参考文献  80-82
第六章 HL-5201抗肿瘤活性研究  82-88
  1 实验材料  82-83
  2 实验方法  83-84
  3 统计分析  84
  4 实验结果  84-86
  5 讨论  86
  6 结论  86-87
  7 参考文献  87-88
附录  88-89
附图  89-91
攻读学位期间成果  91-92
致谢  92-93

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物化学 > 有机合成药物化学
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