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基于果糖自氧化的抗氧化剂筛选方法研究

作　者: 贾曼
导　师: 陈际达
学　校: 重庆大学
专　业: 药物化学
关键词: 果糖自氧化自由基抗氧化剂
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着自由基医学和自由基生物学的发展，自由基和病变的关系越来越受到人们的关注。为此，清除自由基的研究日益引起人们的重视。科研人员建立了许多筛选抗氧化剂和评价抗氧化剂抗氧化能力的自由基产生体系，如经典的产生·OH的Fenton反应和类Fenton反应体系、产生O₂^-·的邻苯三酚体系以及稳定自由基DPPH·、ABTS⁺体系等。然而，这些自由基产生体系生成的自由基均是单一的或者有的自由基并不存在于人体内，与机体的实际情况不符。人体内产生的自由基是多样的、且处于不断变化过程中。自由基的种类、活性、寿命等与其所处的环境有关。而抗氧化剂的抗氧化能力与其清除的自由基种类、活性、环境等密切相关，因此仅仅依据清除某一特定的无变化的自由基难以说明抗氧化剂的实际抗氧化能力，缺乏生理学和病理学意义。研究表明高血糖患者体内单糖的自氧化可产生多种大量活性氧自由基，本文以果糖自氧化过程产生自由基，研究了产生稳定自由基体系的条件，并基于此自由基产生体系进行了抗氧化剂抗氧化能力的评价和筛选。果糖自氧化过程产生动态活性氧自由基与人体内自由基的种类及变化过程相近，以此作为筛选抗氧化剂的体系能全面评价抗氧化剂的抗氧化能力并且有着重要的生理学和病理学意义。本文的主要研究内容如下：①通过考察果糖自氧化的影响因素，对果糖自氧化体系的条件进行优化，建立果糖自氧化体系产生自由基的方法。分别考察了果糖的浓度，催化剂的浓度，温度，pH值等对果糖自氧化的反应速率的影响。产生的活性氧自由基最终转化为·OH，以苯甲酸钠捕获并评价自由基的量。并采用盐酸小檗碱和阿魏酸初步验证了建立的自由基生成体系评价抗氧化能力的方法。②基于果糖自氧化体系以荧光为检测手段对九种抗氧化剂的抗氧化能力进行评价，抗氧化能力选用IC₅₀（半数抑制浓度）的大小作为比对的依据。结果表明多酚类抗氧化剂的抗氧能力与其分子中酚羟基，酮基的个数有密切关系，分子中酚羟基和酮基的个数越多抗氧化能力越强。而生物碱类的抗氧化剂的抗氧化能力和分子中“裸露”的氮原子有关。③基于果糖自氧化体系以高效液相色谱为检测手段，对九种抗氧化剂的抗氧化能力做出评价，以抑制果糖自氧化的裂解标志性产物-甲醛为参考标准，通过比较IC₅₀对抗氧化剂的抗氧化能力做出评价。研究结果表明：多酚类抗氧化剂分子中的酚羟基和酮基的个数越多其抑制甲醛的效果越明显，即抗氧化能力越强。这和用荧光的方法评价结果一致。④参照果糖自氧化的条件应用经典的DPPH·体系，评价了九种抗氧化剂的抗氧化能力。结果表明：一些水溶较好多酚类的抗氧化剂的抗氧化能力与其分子中酚羟基、酮基的个数有关。其结果与荧光、液相方法的评价结果一致。但是，由于DPPH体系是有机溶剂体系并且要求在短时间内完成反应，因此限制了一些水溶性抗氧化剂的应用，对一些需要长时间反应的抗氧化剂的评价也有一定限制。⑤在抗氧化剂研究过程中发现Trolox的抗氧化现象存在异常，即在果糖自氧化体系中经典的抗氧化剂Trolox（水溶性的维生素E）有时不但不表现出抗氧化能力反而有“助”氧化作用。为此，采用NBT（氯化硝基四氮唑蓝）捕获超氧阴离子产生特定的紫外吸收，以及苯甲酸钠捕获羟自由基产生特定的荧光信号对Trolox的自氧化现象进行研究，同时还考察了氧气，温度，pH，Cu²⁺对Trolox自氧化的影响。实验表明高温、酸性条件下Trolox更容易发生自氧化。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
1 绪论  10-19
  1.1 果糖自氧化及其与生理病理的关系  10-12
    1.1.1 果糖自氧化  10
    1.1.2 果糖自氧化与生理病理关系  10-12
  1.2 抗氧化剂对糖自氧化及其引起的糖基化的抑制作用  12-13
    1.2.1 抗氧化剂及其抗氧化机制  12
    1.2.2 不同来源的抗氧化剂对糖基化的抑制作用  12-13
  1.3 抗氧化剂评价方法  13-18
    1.3.1 基于紫外可见吸收检测的抗氧化剂评价方法  14-16
    1.3.2 基于荧光检测的抗氧化剂评价方法  16-17
    1.3.3 基于高效液相色谱（HPLC）的抗氧化剂评价方法  17
    1.3.4 其他评价抗氧化剂方法  17-18
  1.4 本课题的目的和主要研究内容  18-19
2 果糖自氧化体系的建立  19-29
  2.1 引言  19-20
  2.2 实验部分  20-21
    2.2.1 实验仪器与试剂  20
    2.2.2 实验方法  20-21
  2.3 结果与讨论  21-25
    2.3.1 自由基生成体系的荧光表征  21
    2.3.2 果糖浓度对果糖自氧化反应动力学的影响  21-22
    2.3.3 pH 值对果糖自氧化反应动力学的影响  22-23
    2.3.4 温度对果糖自氧化反应动力学的影响  23
    2.3.5 苯甲酸钠浓度的选择  23-24
    2.3.6 铜离子浓度的选择  24-25
  2.4 中药标准品抗氧化能力评价  25-27
    2.4.1 果糖自氧化体系评价盐酸小檗碱和阿魏酸的抗氧化能力  25-26
    2.4.2 抗氧化机理研究  26-27
  2.5 本章小结  27-29
3 基于果糖自氧化体系的荧光法评价抗氧化剂的抗氧化能力  29-34
  3.1 引言  29
  3.2 实验部分  29-30
    3.2.1 实验仪器与试剂  29
    3.2.2 实验方法  29-30
  3.3 结果与讨论  30-33
  3.4 本章小结  33-34
4 基于果糖自氧化体系用 HPLC 法评价抗氧化剂的抗氧化能力  34-40
  4.1 引言  34
  4.2 实验部分  34-35
    4.2.1 实验仪器与试剂  34-35
    4.2.2 实验方法  35
  4.3 结果与讨论  35-38
    4.3.1 甲醛的检测  35-36
    4.3.2 甲醛衍生化时间的考察  36
    4.3.3 抗氧化剂的抗氧化能力评价  36-38
  4.4 本章小结  38-40
5 基于 DPPH 体系以紫外可见法评价抗氧化剂的抗氧化能力  40-43
  5.1 引言  40
  5.2 实验部分  40
    5.2.1 实验仪器与试剂  40
    5.2.2 实验方法  40
  5.3 结果与讨论  40-42
  5.4 本章小结  42-43
6 Trolox 自氧化及 Cu2+对其促氧化的机理研究  43-51
  6.1 引言  43
  6.2 实验部分  43-44
    6.2.1 实验仪器和试剂  43-44
    6.2.2 实验方法  44
  6.3 结果与讨论  44-50
    6.3.1 超氧阴离子生成的紫外可见表征  44-45
    6.3.2 羟自由基生成的荧光表征  45-46
    6.3.3 氧气在 Trolox 自氧化中的作用  46
    6.3.4 不同 pH 条件下铜离子对 Trolox 促氧化作用  46-48
    6.3.5 温度对 Trolox 自氧化的影响  48-49
    6.3.6 Trolox 自氧化和 Cu~(2+)促氧化的可能机理  49-50
  6.4 本章小结  50-51
7 结论与展望  51-53
  7.1 结论  51-52
  7.2 展望  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-60
附录  60-69
  A 已发表和待发表的论文  60
  B 作者在攻读硕士期间参加的科研项目  60
  C 附图  60-69

基于果糖自氧化的抗氧化剂筛选方法研究

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