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胰蛋白酶酶解核桃蛋白的工艺改进

作　者: 宁斌
导　师: 孟庆雄
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 核桃蛋白胰蛋白酶果糖碱性糖基化
分类号: TS201.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目前,大量的研究表明,核桃饮食有延缓衰老、促进健康的作用,近年来,已有很多研究发现核桃提取物中的核桃蛋白、酚类、核桃多肽、核桃油等具有抗氧化和抑制炎症发生的作用,但具体的分子机制还不清楚。我们认为核桃蛋白经过饮食后,被胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等酶类酶解而产生的小肽可能在核桃保健功能中起重要作用。本文就体外胰蛋白酶酶解核桃蛋白产生多肽的酶解条件进行优化。同时,通过提高胰蛋白酶的利用率的实验发现,在碱性条件下,果糖在如极端pH、高温、极端pH、重金属离子等实验条件下对胰蛋白酶都有很好的保护作用,这一研究结果对胰蛋白酶酶解核桃蛋白具有重要的意义。本论文的研究内容主要涉及以下几个方面：1通过L16(45)正交实验确定影响酶解的因素,研究发现胰蛋白酶对核桃的最佳酶解条件为pH 8.5,温度为35℃、底物浓度为35g/kg,E/S为60g/kg,酶解时间为5小时。各因素对核桃蛋白水解的影响顺序为：温度>底物浓度>E/S>时间>pH。另外,我们的研究表明,核桃蛋白酶解产物对巨大芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有较为明显的抑菌效果。2本研究发现,碱性条件下,果糖对胰蛋白酶的稳定性有保护作用,目前还没有相关的报道。在不同的pH条件下,果糖对胰蛋白酶的保护作用还不相同,尤其在pH12时,这种保护作用最为明显,此时果糖处理组的蛋白酶活性仍然保持50%,而未处理组只有24%。3对温度影响处理的研究表明,随着温度的增加胰蛋白酶活性逐渐增加,40℃时达到最大值,随后逐渐降低,20℃时是40℃时的72%,然而70℃时只是40℃时的13%,并且果糖处理组的蛋白酶活性均高于未处理组,在40℃时,这种差异最大。4在pH12的强碱性条件下,10%浓度的果糖对胰蛋白酶就有较好的保护作用,5%的果糖处理组的蛋白酶活性是未处理组的1.55倍,当果糖浓度为10%时,是未处理组的1.66倍,然而,当果浓度为70%时,果糖处理组也只是未处理组的1.54倍。5在碱性条件下,果糖对酶的保护作用随水浴保温时间延长没有明显变化,经过13h后,胰蛋白酶的蛋白酶活性仍然维持为99%,而未处理组/对照组却只有73%。6此外,经果糖处理的胰蛋白酶对金属离子、变性剂SDS等导致酶失活的因素也有明显的去抑制作用,果糖处理组的胰蛋白酶在经过2%的SDS处理30分钟后,蛋白酶活性仍然维持在91%,而未处理组却只有41%。另一方面,SDS-PAGE的结果显示,果糖处理后的胰蛋白酶条带有弥散现象,推测可能出现了糖基化现象,因此,基于上述的研究结果,表明果糖对胰蛋白酶的保护作用可能是通过对胰蛋白酶的糖基化实现的。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
插图和附表清单  11-13
缩略表  13-14
第一章绪论  14-26
  1.1 核桃仁组成成分功能研究进展  14
  1.2 核桃蛋白功能研究  14-16
  1.3 活性肤的研究进展  16
  1.4 生物活性肤及功能食品  16-19
    1.4.1 易消化吸收肤  17
    1.4.2 抗菌肤  17-18
    1.4.3 吗啡片肤  18
    1.4.4 类吗啡拮抗月太  18
    1.4.5 血管紧张素转换酶抑制肤  18
    1.4.6 抑制胆固醇作用肤  18
    1.4.7 促进矿物质吸收肤  18
    1.4.8 机体防御功能肤  18-19
    1.4.9 食品感官肤  19
    1.4.10 肝性脑病防治肤  19
  1.5 活性肤的生产方法  19-20
    1.5.1 天然活性肤的分离提取  19
    1.5.2 化学合成法  19-20
    1.5.3 基因重组法制取活性肤  20
    1.5.4 食品蛋白质水解制取活性肤  20
  1.6 活性多肤功能食品开发  20
  1.7 酶稳定性研究进展  20-24
    1.7.1 化学修饰  21-22
    1.7.2 稳定添加剂  22-23
    1.7.3 果糖的功能研究  23-24
  1.8 本论文的立题依据及创新点  24-25
  1.9 本论文的立题依据及创新点  25-26
第二章胰蛋白酶酶解核桃蛋白条件优化  26-39
  2.1 材料与方法  26-30
    2.1.1 水解度测定:甲醛滴定法  26
    2.1.2 核桃蛋白制备  26-27
    2.1.3 试剂  27
    2.1.4 实验仪器  27
    2.1.5 实验方法和步骤  27-30
  2.2 结果  30-37
    2.2.1 核桃蛋白的酶解单因素实试验  30-32
    2.2.2 正交实验确定最佳酶解条件  32-37
  2.3 结论  37-39
第三章强碱条件下果糖对胰蛋白酶的保护作用研究  39-54
  3.1 材料与方法  39-41
    3.1.1 材料和试剂  39
    3.1.2 实验仪器  39
    3.1.3 实验方法  39-41
  3.2 结果  41-51
    3.2.1 糖对酶稳定性影响  41-42
    3.2.2 不同PH值下果糖对胰蛋白酶的保护作用研究  42-43
    3.2.3 不同浓度果糖对胰蛋白酶活性的影响  43-44
    3.2.4 不同处理时间下,果糖对胰蛋白酶活性的影响  44-45
    3.2.5 果糖处理对胰蛋白酶KM值和半衰期及稳定性的影响  45-46
    3.2.6 果糖对SDS处理的胰蛋白酶保护作用  46
    3.2.7 金属离子对胰蛋白酶活性的影响  46-47
    3.2.8 果糖对胰蛋白酶保护作用机制初步研究  47-48
    3.2.9 Sephadex G-75凝胶分离纯化胰蛋白酶  48-49
    3.2.10 果糖对胰蛋白酶糖基化机制的探讨  49-51
  3.3 讨论  51-54
第四章核桃多肽活抑菌性初步研究  54-58
  4.1 材料与方法  54-55
    4.1.1 材料  54
    4.1.2 主要仪器与设备  54
    4.1.3 实验方法  54-55
  4.2 结果与讨论  55-56
  4.3 讨论  56-58
第五章结论与展望  58-60
致谢  60-61
参考文献  61-65
附录A 在读期间已发表或者待发表的论文  65-66
附录B 02.mol/L磷酸盐缓冲液(pH.S7-~8.0)的配制  66

胰蛋白酶酶解核桃蛋白的工艺改进

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