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胸腺五肽的聚乙二醇修饰及其表征

作　者: 范扩
导　师: 王长海；顾铭
学　校: 南京农业大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 胸腺五肽 聚乙二醇修饰 半衰期 免疫增强作用
分类号: R914.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


聚乙二醇(PEG)修饰技术可以效地降低蛋白和多肽类药物的免疫原性和抗原性、延长蛋白和多肽类药物在体内的循环半衰期、提高蛋白和多肽类药物在体内的综合药效,已成功用于改善多种蛋白和多肽类药物的性质。胸腺五肽(TP5)是一种具有重要应用价值的多肽,对机体免疫功能具有双向调节作用,能使过强或受到抑制的免疫反应趋于正常。本论文探索将mPEG修饰技术应用于TP5,以便解决胸腺五肽临床应用时存在的理化稳定性差、易被蛋白酶水解、在血液中循环半衰期太短等问题。针对胸腺五肽的性质,采用单甲氧基聚乙二醇-丁醛(mPEG-ButyrALD)和单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)两种不同活性末端的聚乙二醇分别修饰N-末端氨基和第二位的赖氨酸,以反相高效液相(RP-HPLC)检测粗产物多肽浓度的方法分析PEG修饰产物的组成,同时监测不同修饰条件下反应动力学数据指导优化修饰工艺条件,以期获得更高的单修饰产物比例。确定mPEG-ButyrALD5000修饰TP5的优选反应条件为：反应缓冲液pH值为5.0,修饰剂肭腺五肽摩尔比为2：1,反应时间55min;mPEG-SPA5000修饰TP5的优选反应条件为：反应缓冲液pH值为8.5,修饰剂／胸腺五肽摩尔比为2.5：1,反应时间为6min。修饰粗产物用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱分离纯化,并超滤除盐、真空冻干干燥后得到最终产物。对单修饰产物分子量、体外酶解稳定性进行了测定,通过x-射线建立了免疫抑制小鼠模型,并对TP5、mPEG-ButyrALD-TP5和InPEG-SPA-TP5等溶液对免疫抑制型小鼠碳廓清能力的影响进行了对比分析。结果表明,分离纯化后mPEG-ButyrALD-TP5和mPEG-SPA-TP5经MALDI-TOF-MS法检测两种产物均为单修饰,分子量5600左右；与未修饰TP5相比,其体外酶解稳定性得到很好的改善；对免疫抑制型小鼠,mPEG-ButyrALD-TP5无显著疗效,mPEG-SPA-TP5和TP5均能提高吞噬细胞的吞噬系数,改善免疫功能,而mPEG-SPA-TP5溶液促免疫药效及作用时间明显高于未修饰的TP5溶液。

全文目录


摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
縮略语  10-11
第一章 文献综述  11-25
  1 胸腺五肽  11-12
    1.1 胸腺五肽来源  11
    1.2 氨基酸序列  11-12
    1.3 生物活性及其应用  12
    1.4 代谢特点  12
  2 多肽和蛋白药物的PEG修饰  12-22
    2.1 MPEG修饰药物的优势及其应用  13-14
    2.2 PEG的结构与基本生物学性质  14
    2.3 MPEG修饰反应的化学基础  14-17
      2.3.1 修饰氨基  15-16
      2.3.2 修饰羧基  16-17
      2.3.3 修饰巯基  17
    2.4 PEG修饰蛋白多肽的反应类型  17-18
      2.4.1 液相反应  17
      2.4.2 固相反应  17-18
    2.5 PEG修饰蛋白多肽的反应方案设计  18-19
      2.5.1 选择合适旳PEG修饰剂  19
      2.5.2 修饰反应条件的优化  19
    2.6 PEG修饰蛋白多肽的分析方法  19-21
      2.6.1 高效液相色谱法  20
      2.6.2 SDS-PAGE凝胶电泳法  20
      2.6.3 圆二色光谱(CD)和荧光光谱分析  20
      2.6.4 质谱(MS)分析  20-21
    2.7 PEG修饰蛋白多肽的分离纯化  21-22
      2.7.1 尺寸排阻色谱法  21
      2.7.2 离子交换层析色谱法  21-22
      2.7.3 反相色谱和疏水层析  22
      2.7.4 亲和层析色谱法  22
  3 本课题的研究目的和研究内容  22-25
    3.1 研究目的  22-23
    3.2 研究内容  23-25
      3.2.1 修饰条件优化  23
      3.2.2 分离纯化  23
      3.2.3 产物表征及药物活性  23-25
第二章 MPEG对TP5的修饰  25-49
  1 引言  25-27
    1.1 修饰反应试验设计  25-27
    1.2 修饰反应流程  27
  2 材料与仪器  27-28
    2.1 主要材料  27-28
    2.2 主要仪器  28
  3 实验方法  28-32
    3.1 检测方法  28-29
      3.1.1 建立反相高效液相(RP-HPLC)检测TP5浓度的方法  28-29
      3.1.2 RP-HPLC分析修饰产物组成  29
    3.2 MPEG修饰胸腺五肽(TP5)实验  29-32
      3.2.1 主要溶液配制  29
      3.2.2 mPEG修饰胸腺五肽(TP5)反应动力学研究  29-30
      3.2.3 胸腺五肽与修饰剂摩尔比对修饰反应的影响  30
      3.2.4 反应缓冲溶液pH值对修饰反应的影响  30-31
      3.2.5 正交试验优化反应工艺  31-32
  4 实验结果  32-45
    4.1 反相高效液相(RP-HPLC)检测TP5浓度  32-37
      4.1.1 RP-HPLC法标准曲线  32-33
      4.1.2 精密度试验结果  33
      4.1.3 回收率试验  33
      4.1.4 RP-HPLC法分析修饰粗产物各成分比例  33-37
    4.2 MPEG修饰TP5工艺优化  37-45
      4.2.1 修饰反应动力学考察  37-39
      4.2.2 胸腺五狀与修饰剂摩尔比对修饰反应的影响  39-41
      4.2.3 反应缓冲溶液pH值对修饰反应的影响  41-42
      4.2.4 正交试验  42-45
  5 小结  45-46
    5.1 反相高效液相(RP-HPLC)检测TP5浓度  45
    5.2 修饰反应动力学研究  45
    5.3 MPEG-BUTYRALD修饰TP5反应的单因素影响考察  45-46
    5.4 MPEG-SPA修饰TP5反应的单因素影响考察  46
    5.5 MPEG修饰TP5反应的正交试验  46
  6 讨论  46-49
    6.1 采用反相高效液相法(RP-HPLC)检测修饰产物组成  46-47
    6.2 MPEG修饰TP5反应的正交试验  47-49
第三章 修饰产物的分离纯化  49-59
  1 引言  49-51
    1.1 修饰产物分离纯化试验设计  49-50
    1.2 修饰产物的分离纯化流程  50-51
  2 材料与仪器  51-52
    2.1 主要材料  51
    2.2 仪器  51-52
  3 实验方法  52-53
    3.1 主要溶液配制  52
    3.2 SP SEPHAROSE FAST FLOW柱料起始缓冲液PH值选择  52-53
    3.3 SP SEPHAROSE FAST FLOW离子交换层析法分离修饰产物  53
    3.4 除盐冷冻干燥  53
    3.5 RP-HPLC纯度检测  53
  4 实验结果  53-57
    4.1 SP SEPHAROSE FAST FLOW离子交换层析柱料缓冲液起始PH值选择  53-54
    4.2 SP SEPHAROSE FAST FLOW离子交换层析法分离修饰产物  54-56
      4.2.1 mPEG-ButyrALD修饰TP5粗产物分离纯化  54-55
      4.2.2 mPEG-SPA修饰TP5粗产物分离纯化  55-56
    4.3 RP-HPLC法分析单修饰产物纯度  56-57
  5 小结  57
    5.1 离子交换层析柱料起始PH值的选择  57
    5.2 SP SEPHAROSE FAST FLOW离子交换层析法用于分离修饰产物  57
  6 讨论  57-59
    6.1 选择MPEG修饰粗产物分离纯化方法  57-58
    6.2 MPEG-SPA-TP5同时出现在峰②和峰③中  58-59
第四章 修饰产物的表征  59-67
  1 引言  59-60
    1.1 MALDI-TOF-MS分析产物分子量分布  59
    1.2 酶解稳定性分析  59
    1.3 体内促免疫效果验证  59-60
  2 材料与仪器  60-61
    2.1 主要材料  60
    2.2 主要仪器  60-61
    2.3 实验动物  61
  3. 实验方法  61-62
    3.1 基质辅助激光解吸时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)分析分子量  61
    3.2 体外酶解稳定性  61
    3.3 体内促免疫效果研究(动物实验)  61-62
  4 实验结果  62-65
    4.1 质谱侧当分子量  62-63
    4.2 修饰产物体外耐酶解稳定性研究  63
    4.3 药物活性  63-65
  5 小结  65
    5.1 单修饰产物分子量  65
    5.2 耐酶解稳定性  65
    5.3 单修饰产物促免疫活性  65
  6 讨论  65-67
    6.1 MALDI-TOF来检测其分子量  65
    6.2 酶解稳定性的初步考察  65-66
    6.3 修饰对整体药效的影响  66-67
全文总结及展望  67-69
创新点  69-71
参考文献  71-77
致谢  77-79
论文发表情况  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物化学 > 有机合成药物化学
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