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Wnt10b调控人毛囊生长的分子机制实验研究

作　者: 张志丹
导　师: 胡志奇
学　校: 南方医科大学
专　业: 整形外科学
关键词: 人毛乳头细胞 Wnt10b 碱性磷酸酶胰岛素样生长因子-1 β-连环蛋白器官培养
分类号: R758.71
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景毛囊是人体内结构和细胞成份最复杂的微小器官,其主要功能是形成毛发组织。胚胎时期毛囊的发育是神经外胚层-中胚层之间相互作用的结果,主要有三种类型的干细胞作用：上皮、神经脊、间充质。根据干细胞的来源,分别分化为上皮系(皮脂腺、分化为内外根鞘细胞和毛发细胞的毛母质角质细胞),间充质系(具有诱导功能的毛乳头细胞,毛囊结缔组织鞘),而神经脊细胞则分化形成能够产生毛囊色素单位的黑色素细胞。许多实验研究显示：成人毛囊生长的过程与胚胎时期毛囊发育的形态发生非常相似,参与胚胎毛囊发育的许多分子信号、细胞因子等在成人毛囊的周期性生长过程中同样具有明显的表达,诱导胚胎时期毛囊形态发生的信号很可能与促进成人毛囊干细胞向毛囊上皮分化的信号相一致。因此,对毛囊的形态发生与发育信号通路的研究,尤其是了解这些信号通路对于成人毛囊周期性生长调控的分子机制,有助于开发促进或者抑制毛发生长的相关药物的研究,从而更快更有效地治疗脱发等相关的毛发疾病。在胚胎发育期间,毛囊的形态发生和发育依赖于真皮和表皮之间一系列信号分子的调控,它们介导了两个不同的细胞群体之间的相互作用,诱导两种细胞进行有序的增殖和特定的分化,并引导细胞最终分化形成内根鞘、外根鞘、毛干,以及毛乳头。这些信号主要包括了Wnt/Wingless家族、SonicHedgehog(Shh),以及转化生长因子β2(TGF-β2)、骨形成蛋白家族(BMPs)、成纤维细胞生长因子家族(FGFs)、外胚叶发育不全基因(Eda/Edar)等。其中,已经有许多实验研究通过基因敲除和转基因的动物模型证实Wnt信号是促进毛囊发育的关键因素。Wnt家族蛋白与果蝇Wingless蛋白同源,是一类脂质修饰的分泌型糖蛋白家族,通过激活细胞表面的受体介导的信号转导通路来调控各种细胞功能作用,例如细胞分化的方向、增殖、迁移、极性分布,以及基因的表达。Wnt蛋白不但对胚胎时期的形态发育具有重要的调控作用,而且参与多种成体组织的再生,如皮肤和毛囊组织。当Wnt蛋白位于细胞表面的受体卷曲蛋白(FZ)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6受体(LRP5/6)家族成员相结合时,能够激活Wnt经典的信号通路。在经典的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路中,卷曲蛋白能够作用于细胞质内的蓬乱蛋白(Dishevelled, DVL),蓬乱蛋白能够切断位于细胞质的β-catenin的降解途径,从而促使β-catenin在细胞质内积累,并进入细胞核,与T细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF-1)相互作用；而当Wnt信号不存在时,细胞质内的β-catenin很快就被降解。Wnt蛋白通过调控TCF/LEF-1来调节靶基因的表达,对多种靶细胞和组织发挥重要的调控作用。Wnt信号决定了未分化表皮细胞的命运,研究表明在转基因小鼠中,当表皮细胞过表达Wnt信号的抑制剂Dickkopfl (Dkk1),或者表皮细胞缺少β-catenin时,结果抑制了毛囊的发育形成；然而,当表皮细胞过表达β-catenin时,毛囊发育异常增多。此外,Wnt信号对出生后毛囊毛干的形成亦起到重要的调控作用,据Millar et.al研究结果表明Wnt3和DVL2在小鼠的毛干前体细胞有明显的表达,当在毛囊的外根鞘中异位表达Wnt3时则导致毛干前体细胞不能成功地分化形成毛干。Kishimoto et.al证实新鲜分离的小鼠毛囊毛乳头细胞能够诱导上皮细胞形成新生毛囊,但是将毛乳头细胞在体外进行传代培养过程中,细胞逐渐丧失诱导毛囊在生的能力。但是经典的Wnt信号能够维持体外培养的小鼠毛乳头细胞的诱导能力,说明可能在体内毛囊上皮细胞的Wnt信号能够作用于毛乳头,从而维持毛乳头细胞的诱导能力。但是人和小鼠的Wnt家族成员总共达到19种之多,究竟是何种Wnt蛋白成员对出生后的人毛囊生长发挥关键的调控作用,而其发挥作用的调控机制是什么迄今为止尚不明确。Seshamma Reddy et.al对在小鼠的表皮和真皮组织中可能表达的所有Wnt成员进行了检测和分析,在小鼠胚胎皮肤和出生后的皮肤中结果发现WntlOb和Wnt5a在毛囊的发育早期特异表达,其中,Wnt10b在胚胎时期皮肤毛囊发育的启动和出生后毛囊生长期启动时表达水平明显上调。不仅如此,以动物为模型的实验结果显示,外源性Wnt10b蛋白能够促进体外培养的小鼠胚胎皮肤毛囊的发育,在众多的Wnt家族成员当中,只有Wnt10b具有诱导未成熟表皮细胞向毛干及内根鞘细胞分化,并且能够刺激体外培养的毛囊毛干生长的能力。因此,Wnt10b可能通过促使表皮和(或者)真皮细胞内β-catenin在细胞质中的积累并向细胞核内转移,启动相关靶基因的表达,继而调控毛囊的发育和生长,对其功能的进一步探讨研究,将有助于开发解决毛发疾病的新的治疗方法。综上所述,Wnt10b在脂肪、骨骼发育以及肿瘤等的形成中具有重要的作用,在胚胎时期毛囊发育过程的基板形成阶段,Wnt10b是最早表达和最显著的标记物之一,说明Wnt10b能够促进上皮细胞的分化和毛囊早期的发育。同时Wnt10b能够在体外促进皮肤上皮细胞向毛囊的毛干和内根鞘细胞分化。然而,目前尚无报道研究Wnt10b在人毛囊组织中的表达如何,如果有表达,是通过何种机制作用于人毛囊细胞?比如人毛乳头细胞,如果Wnt10b能够作用于人毛乳头细胞,那么是通过何种途径实现的?对人毛乳头细胞的生物效应是增强的,还是抑制的呢?此外,Wnt10b对人毛囊毛干的分化形成作用如何?因此我们探讨和研究了Wnt10b调控人毛囊生长的分子机制。首先我们观察Wnt3a. Wnt5a、Wnt10b以及经典的Wnt信号通路下游蛋白β-catenin、LEF-1在生长期人毛囊组织中的免疫组化表达情况,检测上述几种Wnts蛋白的表达水平；接着探讨了人毛乳头细胞经过体外长期的传代培养后,与诱导毛囊生成能力相关的细胞特异性标记物碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)和胰岛素样生长因子-1(Insulin-likegrowth factor-1, IGF-1)的表达情况,以及细胞增殖能力的分析,为进一步分析Wnt10b对人毛乳头细胞毛囊诱导能力以及细胞增殖能力的影响奠定了理论基础；然后证实在Wnt10b的作用下,体外长期培养后的人毛囊毛乳头细胞的生物效应以及人毛乳头细胞增殖情况；最后,我们还初步探讨了Wnt10b对生长期人毛囊毛干生长的作用以及分子调控机制。第一章Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b、β-catenin以及LEF-1在人毛囊组织中的表达目的观察Wnt3a、Wnt5a、Wnt10以及经典的Wnt信号通路下游蛋白β-catenin、 LEF-1在生长期人毛囊组织中的免疫组化表达情况。方法取整形外科除皱手术的额颞部带完整毛囊组织的健康头皮皮肤,将头皮皮肤组织进行石蜡包埋、切片后,使用免疫组织化学染色方法,观察Wnt3a、Wnt5a、 Wnt10b以及经典的Wnt信号通路下游蛋白β-catenin、LEF-1在生长期的人毛囊组织中的表达情况。结果Wnt3a、Wnt5a以及Wnt10b在生长期的人毛囊组织中均可见有表达。Wnt3a在人毛囊的外根鞘、内根鞘、毛母质以及毛干前体细胞中均可见有表达,在毛乳头细胞中可见微弱的表达；而Wnt5a在毛囊的分布范围较Wnt3a局限,可见只有在毛母质,毛干前体细胞和内根鞘中有表达,而且表达较微弱。Wnt10b在生长期人毛囊表达部位和Wnt3a相似,但是表达强度是上述三种Wnts中最强的,除了结缔组织鞘以外,在毛囊的各层结构如内根鞘、外根鞘、毛母质细胞以及毛干前体细胞中均有明显的表达,而在毛乳头亦可见微弱的表达。β-catenin和LEF-1是经典的Wnt信号通路两个下游蛋白,它们在生长期的人毛囊中均有表达。其中β-catenin在毛母质细胞、毛干前体细胞和内根鞘中有明显的阳性表达,在毛乳头细胞中有微弱的表达；而LEF-1和β-catenin的表达部位几乎一致,只是在毛乳头细胞中的表达较强。结论Wnt3a、Wnt5a以及Wnt10b在生长期的人毛囊组织中均可见有表达,其中以Wnt10b的表达最强,主要分布在毛囊的内根鞘、外根鞘、毛母质细胞以及毛干前体细胞中,而在毛乳头细胞中亦可见微弱的表达,而经典的Wnt信号通路了两个下游蛋白β-catenin和LEF-1在毛母质细胞、毛干前体细胞和内根鞘,以及毛乳头细胞中有明显的阳性表达,说明Wnt10b可能是通过经典的Wht/β-catenin信号通路来维持和调控处于生长期的人毛囊生长主要的Wnt家族成员。第二章体外培养的人毛乳头细胞特异性标记物表达及细胞增殖能力的分析目的探讨人毛乳头细胞经过体外长期的传代培养后,与诱导毛囊生成能力相关的细胞特异性标记物碱性磷酸酶和胰岛素样生长因子-1的表达情况,以及细胞增殖能力的分析。方法使用胶原酶消化+显微解剖法将人毛乳头从毛囊中分离后,在体外进行人毛乳头细胞的传代培养,使用real-time QPCR和碱性磷酸酶染色方法检测第1代～第8代的人毛乳头细胞在不同传代时期其特异性标记物ALP和IGF-1的表达结果,以及通过Cell Counting Kit-8方法检测不同的传代时期人毛乳头细胞增殖能力。结果人毛乳头细胞在体外进行长期的传代培养过程中,不但逐渐丧失其旋涡状聚集性的生长特性,而且ALP和IGF-1随着传代代数的增加,其表达水平是逐渐降低的。第1代人毛乳头细胞ALP和IGF-1表达水平分别是第8代细胞表达水平的6.8和3.5倍。第1代和第2代的人毛乳头细胞ALP染色表达较明显,但是在第3-6代的人毛乳头细胞中,ALP阳性的细胞逐渐变少,而且染色逐渐变浅；高传代细胞如第7、8代细胞的ALP活性表达则非常微弱。不同传代时期的人毛乳头细胞增殖能力,亦随着传代代数的增加而逐渐下降,从传代培养到第7代开始,细胞增殖能力出现一个分水岭,明显较第6代以前的细胞增值能力低。结论人毛乳头细胞经过体外长期的传代培养后,和诱导毛囊生成能力相关的特异性标记物的表达水平逐渐下降,从而导致高传代的人毛乳头细胞丧失诱导毛囊生长的能力。此外,人毛乳头细胞亦随着体外培养传代代数的增加,其增殖能力逐渐降低。第三章Wnt10b对体外培养的人毛乳头细胞诱导毛囊生成能力的调控作用及对人毛乳头细胞增殖的影响目的探讨Wnt10b对体外长期培养后的人毛囊毛乳头细胞诱导毛囊生成能力的调控作用以及对人毛乳头细胞增殖能力的影响。方法将人毛乳头细胞原代分离,在体外传代培养到第8代后,加入Recombinant Human Wnt-10b共培养,通过免疫荧光染色方法检测人毛乳头细胞的β-catenin表达,观察细胞的生长情况,并使用Real-time QPCR检测与毛乳头细胞诱导能力相关的特异性标记物ALP和IGF-1的表达,碱性磷酸酶染色检测Wnt10b对人毛乳头细胞的作用,以及通过Cell Counting Kit-8方法检测Wnt10b对人毛乳头细胞增殖的影响作用。结果Wnt10b能够通过经典的Wnt/β-catenin信号通路作用于在体外长期培养后的人毛乳头细胞,上调人毛乳头细胞特异性标记物ALP和IGF-1的表达,并恢复高传代人毛乳头细胞聚集性漩涡状生长特性,从而维持人毛乳头细胞的诱导能力。此外,Wnt10b对体外经过长期传代培养后的人毛乳头细胞增殖具有促进作用。结论Wnt10b能够通过上调特异性标记物ALP和IGF-1的表达以及恢复高传代人毛乳头细胞聚集性漩涡状生长特性来维持体外长期培养后的人毛乳头细胞的毛囊诱导能力,以及具有促进长期培养后的人毛乳头细胞增殖能力的作用。第四章初步探讨Wnt10b对人毛囊毛干生长的影响作用目的Wnt10b对生长期人毛囊毛干生长的影响作用及调控机制的初步探讨。方法将人毛囊组织进行显微解剖分离后,分为空白对照组和实验组。①空白对照组：人毛囊+DMEM基础培养基培养。②实验组：将Recombinant Human Wnt-10b2μg/ml加入DMEM基础培养基中,和人毛囊共培养。上述实验分组每组设6个毛囊样本,3天换液一次,培养5天后,在双目体视解剖显微镜下测量各实验组毛干生长长度。结果将完整的生长期人毛囊进行器官培养,实验组相比于空白对照组,和Recombinant Human Wnt-10b共培养的人毛囊毛干生长速度明显增加,毛干长度比对照组长。结论实验结果显示,在空白对照组中,将人毛囊器官和无血清的培养基培养后,毛干生长速度缓慢；而在实验组中,由于加入了Recombinant Human Wnt-10b,毛干生长速度明显较空白对照组快,毛干生长长度更长,证实Wnt10b对人毛干的生长具有明显的促进作用。全文小结1.在生长期的人毛囊组织上检测Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b以及经典的Wnt信号通路下游蛋白β-catenin和LEF-1的表达情况,其中Wnt10b的阳性表达最明显,而β-catenin和LEF-1与Wnt10b在毛母质、毛干前体细胞和内根鞘,以及毛乳头出现表达重叠的现象,说明Wnt10b可能是通过经典的Wnt/β-catenin信号通路来维持和调控处于生长期的人毛囊生长主要的Wnt家族成员。2.检测了人毛乳头细胞经过体外长期的传代培养后,与诱导毛囊生成能力相关的细胞特异性标记物ALP和IGF-1的表达情况,以及细胞增殖能力的分析。实验结果说明经过体外长期的传代培养后,人毛乳头细胞的ALP和IGF-1表达水平和细胞的增殖能力并不是恒定不变的,而表现为一种逐渐下降的趋势,为进一步验证Wnt10b对人毛囊生长的调控作用提供了理论基础；3.观察了Wnt10b对体外长期培养后的人毛囊毛乳头细胞诱导毛囊能力的调控机制,以及细胞增殖能力的影响作用,证实了Wnt10b具有能够维持人毛乳头细胞的诱导能力以及促进其增殖的作用；4.初步探讨Wnt10b对人毛囊毛干的作用,证实了Wnt10b能够促进人毛囊毛干的生长；5.体外实验结果说明了Wnt10b能够作用于人毛囊组织的两种主要的细胞成分：真皮成分(毛乳头细胞)和上皮成分(毛母质细胞、毛干前体细胞),证实Wnt10b对生长期的人毛囊生长具有重要的调控作用。

全文目录

摘要  3-11
ABSTRACT  11-23
前言  23-30
  参考文献  27-30
第一章 Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b、β-catenin以及LEF-1在人毛囊组织中的表达  30-47
  引言  30-35
  材料和方法  35-37
  结果  37-43
  讨论  43
  结论  43-44
  参考文献  44-47
第二章体外培养的人毛乳头细胞特异性标记物表达及细胞增殖能力的分析  47-68
  引言  47-50
  材料和方法  50-54
  结果  54-63
  讨论  63-65
  结论  65
  参考文献  65-68
第三章 Wnt10b通过Wnt/β-catenin信号途径维持体外培养的人毛乳头细胞的毛囊诱导特性  68-90
  引言  68-72
  材料和方法  72-76
  结果  76-84
  讨论  84-87
  结论  87
  参考文献  87-90
第四章初步探讨Wnt10b对人毛囊毛干生长的影响作用  90-98
  引言  90-91
  材料和方法  91-92
  结果  92-95
  讨论  95
  结论  95-96
  参考文献  96-98
全文讨论  98-108
  参考文献  104-108
全文小结  108-109
综述  109-120
  参考文献  116-120
攻读期间成果  120-121
中英文缩略词对照表  121-122
致谢  122-124
统计学审稿证明  124

Wnt10b调控人毛囊生长的分子机制实验研究

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