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骨形成蛋白-2质粒体内转染治疗牙周骨缺损的实验研究

作　者: 赵聪
导　师: 钟晓波
学　校: 重庆医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 骨形成蛋白-2 基因转染牙周再生基因治疗
分类号: R781.42
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：牙周炎是一种严重危害人民群众身心健康的慢性疾病。牙周炎导致的牙周组织破坏尤其是骨组织的缺损,很难通过常规治疗手段达到完善的修复。近年来一些牙周再生治疗已经在临床得到应用,如引导组织再生术、细胞因子的应用等。但是受限于前体细胞少导致再生牙周组织也较少、细胞因子局部应用疗效难以保证等缺陷,应用受到一定的限制。基因治疗的发展为牙周炎的再生治疗创造了新的途径,通过目的基因骨形成蛋白-2对靶细胞的转染,起到增强相关细胞因子表达的作用,在局部微环境促进前体细胞的分化,增强牙周骨形成的效用,有望为牙周炎的再生治疗取得新的突破。目的：构建并鉴定用于基因治疗的含有目的基因骨形成蛋白-2蛋白质编码区(CDS)片段的真核表达载体pEGFP-N1BMP2质粒,将质粒通过局部组织注射的方法,体内转染实验性SD大鼠牙周骨缺损动物模型,通过随机对照实验观察转染质粒后牙周骨组织再生的情况,为牙周炎骨缺损的基因治疗提供一定的实验基础。方法：根据Gen-Bank中hBMP2cDNA序列中蛋白质编码区序列设计并合成PCR引物。从人胎盘绒毛膜细胞中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应获取目的基因人骨形成蛋白-2CDS片段。将获得的DNA片段连接pMD19-T载体,经测序验证正确后,经过双酶切反应,将hBMP2目的基因CDS片段切下,并与真核表达载体pEGFP-N1连接,获得基因治疗的质粒载体pEGFP-N1-BMP2。利用菌液PCR、测序、双酶切等方法进行质粒鉴定,鉴定正确后提取高纯度的质粒。通过口外途径翻瓣,慢速球钻局部去骨形成SD大鼠牙周骨缺损动物模型,并进行随机分组。实验组(n=10)：将总量为15μ的质粒水溶液通过局部注射的方法体内转染大鼠牙周组织,对照组(n’=10)：局部给予注射等体积的双蒸水(ddH2O)作为空白对照。所有动物处理完毕后常规饲养4周,处死动物并取材切片观察牙周组织再生情况。结果：真核表达载体pEGFP-N1-BMP2构建成功,通过菌液PCR、测序及双酶切鉴定显示正确。体内转染质粒后观察牙周骨缺损的生长情况：实验组观察到较多的新生牙槽骨,有牙骨质及功能性牙周膜纤维的形成；对照组观察到的新生牙槽骨数量少且钙化不良,无明显牙骨质及功能性牙周膜纤维的形成。通过图像分析软件测量新生牙槽骨面积占牙周骨缺损面积的百分比,对比显示实验组大于对照组(p<0.05);测量新生牙槽骨冠根向高度占缺损冠根向长度的百分比,显示实验组亦大于对照组(p<0.05)。结论：pEGFP-N1BMP2质粒对SD大鼠实验性牙周骨缺损的体内转染,通过对照实验观察到了一定的促进骨组织再生的效果,提示BMP2基因转染可能有利于牙周骨组织的再生,为牙周炎骨缺损的治疗提供了一定的实验基础。

全文目录

英汉缩略语名词对照表  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-13
第一章重组质粒的构建和鉴定  13-24
  1 材料和方法  13-20
  2 结果  20-22
  3 讨论  22-23
  4 小结  23-24
第二章牙周骨缺损动物模型的建立和观察局部转染pEGFP-N_1-BMP_2质粒后牙周骨缺损再生的情况  24-29
  1 材料和方法  24-25
  2 结果  25-27
  3 讨论  27-28
  4 小结  28-29
全文总结  29-30
参考文献  30-32
附图  32-33
文献综述  33-40
  参考文献  37-40
致谢  40-41
攻读硕士学位期间发表的学术论文  41

骨形成蛋白-2质粒体内转染治疗牙周骨缺损的实验研究

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