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BMP9调控小鼠根尖牙乳头干细胞成牙本质分化及其机制的初步研究

作　者: 王金华
导　师: 邓锋
学　校: 重庆医科大学
专　业:
关键词: CD1小鼠酶消化法根尖牙乳头干细胞永生化结晶紫 MTT 胎盘蓝增值率免疫荧光间充质干细胞标志物骨形态发生蛋白9 成牙本质分化体外细胞实验体内动物实验
分类号: R781.05
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

第一部分CD1小鼠原代根尖牙乳头干细胞提取、培养、永生化目的：CD1小鼠根尖牙乳头干细胞原代培养及永生化。方法：断颈处死CD1小鼠,拔出小鼠下颌中切牙,从牙根尖表面轻轻用组织剪离断根尖牙乳头,采用Ⅰ型胶原酶消化法,消化分离的根尖牙乳头组织块,传代培养。采用SV40大T抗原逆转录病毒方法转染原代细胞,hygromycin B药物进行筛选,构建小鼠永生化根尖牙乳头干细胞系。结果：胶原酶消化根尖牙乳头组织块后的原代细胞,细胞呈现为梭形、多角形、纺锤形,类似于成纤维细胞。贴壁生长后的细胞平铺,呈现为多边形,体积大。hygromycin B药物筛选后,能生存下来的细胞说明成功转染,培养表现为杀死细胞漂浮,存活细胞仍然贴壁生长。MAPs传代到一定程度后细胞增殖能力停滞,iMAPs增殖能力伴随传代增长的细胞慢慢融合,增殖能力持续。MAPs与iMAPs传代后倍增能力存在显著性差异(P<0.05)。结论：Ⅰ型胶原酶消化组织块法能有效提取、分离和原代培养小鼠根尖牙乳头干细胞。采用SV40大T抗原逆转录病毒转染原代细胞,Hygromycin B药物筛选法,能成功构建永生化的小鼠根尖牙乳头干细胞系,是后续牙组织再生工程研究的前提和基础。第二部分定量比较MAPs与iMAPs细胞系增殖率等生物学特性目的：定量比较MAPs与iMAPs细胞系增殖率等生物学特性。方法：通过结晶紫染色法、MTT法、胎盘蓝染色法等来检测MAPs与iMAPs细胞之间的差异性。结果：结晶紫染色及扫描结果显示：iMAPs及MAPs两者之间的增殖率存在显著性差异(P<0.05);MTT法测量结果显示：iMAPs及MAPs两者之间的增殖率存在显著性差异(P<0.05)；胎盘蓝染色结果显示：iMAPs细胞的存活率及增值能力均明显高于MAPs (P<0.05)。结论：永生化后的小鼠根尖牙乳头干细胞系与原代细胞系相比,具有更好的存活率及增值率。对今后的组织工程及再生医学研究具有重要的意义。第三部分免疫荧光法检测iMAPs细胞MSC标志物的表达目的：通过免疫荧光法检测iMAPs细胞MSC标志物的表达。方法：将iMAPs细胞接种到24孔培养板中,用10%福尔马林室温下固定,用10%BSA室温下封闭,在实验组每孔中加入一抗,对照组每孔中加入PBS,随后加入荧光二抗,加入DAPI,荧光倒置显微镜下,不同放大倍数下观察细胞并采集图像。结果：iMAPs表达MSC标志物,如：BMPRⅡ、CD117(c-kit)、 CD29(Integrinβ1)、CD44、CD73、CD90(Thy-1)、CD105(Endoglin)、 CD133(Prom1)、CD166(ALCAM)。不表达CD14、CD34及CD45。结论：永生化后的iMAPs细胞保持了MSC干细胞特性。第四部分BMP9调控iMAPs及MAPs体外成牙本质分化的影响目的：体外细胞实验,检测BMP9对iMAPs及MAPs细胞早期ALP的表达、晚期OCN及OPN表达以及基质矿化作用；同时通过RT-PCR检测成牙本质分化相关目的基因的表达；从微观角度阐明其对iMAPs及MAPs细胞分化的调控作用。方法：扩增并提取高滴度的Ad-BMP9及Ad-GFP病毒,iMAPs及MAPs分别被病毒感染,成牙本质细胞分化有不同的标志物。碱性磷酸酶活性是细胞成牙本质分化的早期表现,晚期阶段,茜素红染色检测基质的矿化作用,细胞免疫组化检测骨桥蛋白和骨钙素表达；同时在不同时间点收集腺病毒感染iMAPs及MAPs细胞的RNA,然后转化为cDNA,通过RT-PCR,检测成牙本质分化等相关目的基因的表达。结果：(1)实验扩增的腺病毒Ad-GFP及Ad-BMP9感染效率高,iMAPs及MAPs细胞能被有效感染。(2)逆转录PCR结果：在BMP9刺激iMAPS及MAPs细胞后,相关目的基因表达有明显的上调,尤其是与成牙本质分化关系非常密切的基因MEPE、DSPP及DMP1有明显的上调。(3)ALP活性、染色及扫描结果表明,Ad-GFP不能诱导iMAPs及MAPs细胞ALP活性升高。Ad-BMP9在检测的三个时间点均能显著促进iMAPs及MAPs细胞ALP活性升高。(4)细胞免疫组织化学染色法结果表明,Ad-GFP感染细胞后,未检测到骨桥蛋白和骨钙素的表达。而Ad-BMP9感染细胞后,能检测到骨桥蛋白和骨钙素的表达。(5)茜素红染色结果表明,Ad-BMP9组中的基质矿化作用显著高于Ad-GFP组,Ad-GFP组未见有明显的基质矿化作用。结论：BMP9在体外能早期促进小鼠根尖牙乳头干细胞ALP活性增强,晚期OCN、OPN表达,以及促进基质的矿化作用。能有效调控iMAPs及MAPs细胞成牙本质分化,相关目的基因表达上调。第五部分BMP9调控iMAPs体内成牙本质分化的影响目的：通过体内干细胞移植实验,证实BMP9信号能有效促进小鼠根尖牙乳头干细胞成牙本质分化作用,从宏观角度阐明其对iMAPs细胞成牙本质分化的调控作用。方法：将Ad-GFP、Ad-BMP9感染的iMAPs细胞注射到无胸腺裸鼠皮下及后腿肌肉内。注射4周后,断颈处死裸鼠,收集移植部位异位形成的组织块,进行微型计算机断层扫描,通过Amira5.3软件将扫描结果进行三维重建并进行统计分析。另外,对异位形成的组织块常规石蜡包埋,制备石蜡切片并进行组织学分析：H&E染色、阿辛蓝染色、Masson’s Trichrome染色。结果：(1)干细胞移植实验结果表明,Ad-GFP对照组不能在无胸腺裸鼠体内环境下形成异位类牙本质,而Ad-BMP9实验组能形成异位类牙本质。Micro-CT扫描结果显示,Ad-BMP9产生的异位类牙本质的平均体积及平均密度均显著高于Ad-GFP对照组(P<0.05)。(2)组织块H&E染色结果显示,BMP9诱导生成的异位类牙本质中,能看到部分成熟的细胞和成束胶原纤维包埋在基质中,形态似带状、框架结构等；同时可观察到未分化的早期细胞。也能看到分化后形成的脂肪组织结构。(3) Ad-BMP9感染iMAPs细胞后,形成的异位类牙本质组织中可观察到骨桥蛋白和骨钙素的表达。(4) Ad-BMP9感染iMAPs细胞后,阿辛蓝染色中发现有硫酸软骨素钙盐及软骨基质的沉积。这说明BMP9能促进小鼠根尖牙乳头干细胞的分化,并存在多向分化的潜能,以不同的方式形成类牙本质。(5) Masson’s Trichrome染色结果显示,Ad-BMP9感染iMAPs细胞后,类牙本质组织块中能看到成熟和矿化的基质。结论：BMP9在体内能有效调控iMAPs细胞成牙本质分化,在裸鼠皮下及后腿肌肉能形成异位的类牙本质块。

全文目录

英汉缩略语名词对照  6-8
摘要  8-14
ABSTRACT  14-21
前言  21-27
  1 年轻恒牙外伤治疗需要  21-22
  2 根尖周组织再生的可能性  22-23
  3 骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)的研究背景  23-25
  参考文献  25-27
第一部分 CD1小鼠原代根尖牙乳头干细胞的提取、培养、永生化  27-40
  1 材料与方法  27-31
  2 实验结果  31-36
  3 讨论  36-37
  4 本章小结  37-38
  参考文献  38-40
第二部分定量比较MAPs与iMAPs细胞系增殖率等生物学特性  40-51
  1 材料与方法  40-44
  2 实验结果  44-48
  3 讨论  48-49
  4 本章小结  49
  参考文献  49-51
第三部分免疫荧光法检测iMAPs细胞MSC标志物的表达  51-58
  1 材料与方法  51-54
  2 实验结果  54
  3 讨论  54-55
  4 本章小结  55-56
  参考文献  56-58
第四部分 BMP9调控iMAPs及MAPs体外成牙本质分化的影响  58-83
  1 材料与方法  58-68
  2 实验结果  68-74
  3 讨论  74-78
  4 本章小结  78-80
  参考文献  80-83
第五部分 BMP9调控iMAPs体内成牙本质分化的影响  83-97
  1 材料与方法  83-88
  2 实验结果  88-93
  3 讨论  93-95
  4 本章小结  95-96
  参考文献  96-97
全文总结  97-99
文献综述  99-108
  参考文献  104-108
致谢  108-109
攻读学位期间发表的文章  109-113

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