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人肝癌干/祖样细胞对肝脏损伤作用的研究

作　者: 王利娟
导　师: 姚智
学　校: 天津医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 肝癌干细胞 球形体细胞 生存时间 肝损伤
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：观察从肝癌细胞系中分离的肝癌干／祖样细胞(Hepatocarcinoma stem cell, HSC)对NOD/SCID小鼠生存时间的影响,并从体内和体外两方面初步探讨其引起NOD/SCID小鼠死亡的可能原因。方法：1.无血清悬浮培养法分离培养肝癌SK-Hep-1细胞中的肝癌干/祖样细胞(球形体细胞,spheroid cells, SC);2.应用MTS和流式细胞术观察球形体细胞增殖和细胞周期分布的情况；3.软琼脂克隆形成实验观察球形体细胞的自我更新、无限增殖能力：NOD/SCID小鼠体内成瘤实验观察球形体细胞的体内成瘤能力；4.应用MTS法检测球形体细胞对化疗药物(5-Fu、DDP、ADM和NVB)的敏感性；5.应用实时荧光定量PCR和免疫印迹法观察球形体细胞干细胞基因Oct-4、Nanog、BMI-1、Notch-1以及SMO mRNA和蛋白的表达水平；6.肝癌干/祖样细胞接种NOD/SCID小鼠观察肝癌干/祖样细胞对荷瘤小鼠生存时间的影响;7.HE染色显微镜下观察NOD/SCID小鼠各个脏器组织结构的变化；检测肝癌干/祖样细胞对NOD/SCID小鼠血液生化指标(肝功能)的影响,应用Tunel和PCNA染色观察肝癌干/祖样细胞对小鼠肝脏凋亡及增殖情况的影响；8.胶原酶消化法分离小鼠原代肝细胞并培养；9.流式细胞术联合CFSE染色检测肝癌干/祖样细胞体外对小鼠和人正常肝细胞增殖的影响；10.流式细胞术联合AnnexinV/PI双染检测肝癌干/祖样细胞体外对小鼠和人正常肝细胞凋亡的影响；11.流式细胞术联合PI染色检测肝癌干/祖样细胞体外对小鼠和人正常肝细胞周期分布的影响。结果：1. SK-Hep-1细胞可在添加生长因子的无血清培养基中呈球形悬浮生长并可长期培养、扩增。2.球形体细胞呈低增殖状态,大多数处于静止期,即细胞周期G0/G1期。3.球形体细胞和SK-Hep-1细胞在双层软琼脂培养基中均可呈克隆性生长,球形体细胞克隆形成率为51.63%,显著高于SK-Hep-1细胞,具有更强的克隆形成能力；体内成瘤性实验显示球形体细胞具有较强的致瘤能力,1000个球形体细胞接种于NOD/SCID小鼠皮下即可形成肿瘤,并能分化出与原代细胞特征相仿的肿瘤细胞。4.药物敏感性分析结果显示,经不同化疗药物作用48hrs,球形体细胞活性明显高于SK-Hep-1细胞,对化疗药物具有更强的耐受性。5.球形体细胞中干细胞基因Oct4、Nanog、BMI-1、Notchl、和SMO mRNA和蛋白的表达水平明显高于SK-Hep-1细胞。6.生存分析可见HSC接种的NOD/SCID小鼠组生存时间与SK-Hep-1组相比明显缩短。7.HE染色显微镜下观察HSC组小鼠的肝脏组织肝索紊乱,肝细胞呈大小不等的空泡样变,嗜酸性变,可见小灶性坏死,肝窦扩张,单核巨噬细胞重度增生,病变较SK-Hep-1组明显加重；HSC组小鼠肝功能指标中.白蛋白水平下降,ALT水平升高；Tunel结果显示HSC组小鼠肝组织凋亡细胞的数量较SK-Hep-1组明显增加；PCNA染色结果显示SK-Hep-1和HSC组小鼠的肝组织均有PCNA阳性细胞,但是与SK-Hep-1组相比,HSC组的阳性细胞较少。8.小鼠原代肝细胞体积大,呈多边形或不规则形,单核或双核,细胞界限清楚。9.HSC细胞培养上清及HSC与肝细胞共培养均能够抑制肝细胞的增殖,与SK-Hep-1细胞相比,HSC对肝细胞增殖抑制的作用更为明显。10.HSC细胞培养上清能够诱导肝细胞的凋亡,与SK-Hep-1细胞比较,HSC上清对肝细胞凋亡的促进作用更加明显。HSC和SK-Hep-1细胞与正常肝细胞共培养对肝细胞凋亡均没有影响。11.HSC细胞培养上清及HSC细胞与肝细胞共培养均能够引起肝细胞S期百分比升高,G0/G1、G2/M期百分比均出现不同程度的降低,与SK-Hep-1细胞相比,HSC对肝细胞具有更强的细胞周期阻滞作用。结论：经无血清悬浮培养法从人肝癌SK-Hep-1细胞系中分离得到了具有肿瘤干细胞特性的肝癌干/祖样细胞(Hepatocarcinoma stem-like cell, HSC)亚群；HSC在体内表现出较强的肝损伤作用,促进肝细胞凋亡,并且抑制肝细胞的增殖再生；同时体外实验进一步验证了HSC具有抑制肝细胞增殖、促进肝细胞凋亡、引起细胞周期阻滞的作用；由此可见,肝癌干/祖样细胞诱导肝细胞凋亡,引发肝细胞损伤以及抑制肝细胞再生修复可能是导致荷瘤小鼠死亡率升高,生存期缩短的原因之一。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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