学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

Has-miR-139调控人结肠癌细胞浸润转移及多药耐药的分子机理研究

作　者: 沈克
导　师: 刘建文
学　校: 华东理工大学
专　业: 药物化学
关键词: MicroRNA(miRNA) 结肠癌 IGF1R 浸润 转移 多药耐药
分类号: R735.35
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
下　载: 136次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


结肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是一种死亡率非常高的恶性肿瘤,居恶性肿瘤死因的第三位。CRC的高死亡率主要是由于频发的术后转移和对化疗药物产生的多药耐药性(Multi-drug Resistance, MDR)造成的。所以,积极寻找有效的治疗结肠癌的方法和药物已成为目前抗肿瘤研究领域的热点。微小RNA (MicroRNA, miRNA)是一类新发现的非编码小RNA分子,它们能够通过与靶基因mRNA上的特定序列结合,通过抑制靶基因蛋白质翻译或剪切靶基因的mRNA分子从而起到对靶基因的调控作用。到目前为止,已有大量的研究报道发现这种小RNA分子几乎参与调控了细胞生命周期中所有的关键步骤,且miRNA的异常表达也是生物体产生疾病的一大重要原因。因此,深入开展miRNA在癌症中发生,调控与受调控机制及生物学功能的研究将能够帮助我们提高对结肠癌的认识和临床诊断、治疗的水平。为了发现能够在结肠癌中发挥重要调控作用的miRNA,本研究使用高通量Agilent人类miRNA芯片(V.12.0)检测了6例不同病理分型的结肠癌患者组织及其相对应的正常组织中873条miRNA的表达谱,于所筛选出的13条在结肠癌病例中表达量显著异常的niRNA(p<0.05,差异倍数>2)中选择表达量下降最为明显的niR-139-5p作为研究对象。通过使用Real-Time PCR方法检测34例不同病理分型的结肠癌患者组织及其相对应的正常组织中miR-139-5p的表达量,本研究发现,miR-139-5p在34例结肠癌标本中普遍异常低表达,从而验证了miRNA芯片的结果。在此基础上,通过瞬时转染和稳定转染等分子生物学技术在结肠癌细胞中过表达miR-139-5p,本研究发现无论在体内还是体外,miR-139-5p均显示出显著的抑制结肠癌细胞浸润转移的能力(体外p<0.001,体内p=0.0079)。同时发现,其调控结肠癌细胞增殖的能力则并不显著(体外p>0.05,体内p>0.05)。本研究结合生物信息学预测与双荧光素酶报告基因方法,发现Ⅰ类胰岛素样生长因子受体(Type I Insulin-like Growth Factor Receptor, IGF1R)是miR-139-5p的一个关键靶基因。MiR-139-5p能够通过与IGF1R的3’非转录区(3’UTR)结合,抑制IGF1R的蛋白翻译,使IGF1R下游的MEK/ERK信号通路失活,从而抑制MMP-2的转录活性并最终影响结肠癌细胞的浸润及转移能力。本研究同时发现miR-139-5p与结肠癌恶性程度(p=0.02),淋巴结转移(p=0.02),血管浸润(p<0.01),器官远端转移(p=0.03)等诸多临床病理特征也密切相关。本研究进一步探讨了结肠癌细胞中miR-139-5p异常低表达的分子机制。MiR-139位于11号染色体并且是磷酸二酯酶2A(Phosphodiesterase2A, PDE2A)基因2号内含子的一部分。然而miR-139(前体与成熟体)与宿主基因的表达量在34例结肠癌病例中并无显著相关性。本研究发现PDE2A激动剂无法调控miR-139胞内表达量,通过染色质免疫共沉淀方法确定miR-139具有独立的转录起始位点。此外,本研究确定了组蛋白乙酰化转移酶在结肠癌中对miR-139表达量的调控能力。通过检测miR-139前体分子pre-miR-139及其靶基因IGF1R, ROCK2和RAP1B在34例结肠癌病例中的表达量,发现靶基因的过表达可能与miR-139的低表达相关。过表达靶基因的3’UTR能够下调包括miR-139-5p在内的多个miRNA的胞内表达量。因此,转录后调控也是造成]miR-139-5p在结肠癌病例中异常低表达的一个重要因素。MiR-139-5p的靶基因能够通过miR-139-5p影响各自的蛋白表达量从而形成一个复杂的分子信号转导和调控网络,同时本研究也首次发现了IGF1R, ROCK2及RAP1B的3’UTR在结肠癌细胞中所发挥的生物学功能。通过对耐药结肠癌细胞亚株的研究发现miR-139-5p与靶基因IGF1R的表达量较亲本株相比分别显著低表达及过表达(p<0.001,p<0.01)。敲除IGF1R或过表达miR-139-5p同样能够抑制下游PI3K/AKT/Nrf2/MRP-2信号通路从而显著抑制结肠癌耐药细胞的体外增殖同时增加细胞对抗癌药物的敏感性。通过检测耐药细胞株中肿瘤干细胞相关表面标志物CD44和CD133发现耐药细胞表现出一定程度的肿瘤干细胞样特性。结合生物信息学预测与双荧光素酶报告基因方法,本研究发现了一个新的miR-139-5p靶基因Notch-1。MiR-139-5p能够同时调控IGF1R及结肠癌Notch-1的蛋白表达量从而影响细胞的耐药性。综上所述,本研究从分子,细胞,组织和整体动物水平等多个方面验证了抑癌基因miR-139-5p调控结肠癌细胞浸润转移及多药耐药的作用及其分子机制。本研究的结果表明：miR-139-5p可以作为结肠癌相关的一个分子标志物,无论在疾病的诊断还是在药物治疗靶点的发现或新型抗肿瘤药物的研究中均具有潜在的应用价值。为在结肠癌的分子病理诊断,相关药物的分子靶向治疗及预后的评价等多个方面提供了一定的理论依据及新思路。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
缩略语表  9-17
第1章 绪论  17-34
  1.1 MiRNA介绍  17-20
    1.1.1 概述  17
    1.1.2 MiRNA的生物合成机制  17-18
    1.1.3 MiRNA的功能及其作用机制  18-19
    1.1.4 MiRNA的鉴定方法  19
    1.1.5 MiRNA的检测方法  19-20
  1.2 MiRNA与癌症  20-27
    1.2.1 概述  20
    1.2.2 MiRNA与肿瘤细胞凋亡的关系  20-21
    1.2.3 MiRNA与肿瘤细胞自噬的关系  21-22
    1.2.4 MiRNA与肿瘤细胞血管新生的关系  22
    1.2.5 MiRNA与肿瘤细胞周期的关系  22-23
    1.2.6 MiRNA与细胞老化的关系  23-24
    1.2.7 MiRNA与肿瘤细胞浸润转移的关系  24-26
    1.2.8 MiRNA与肿瘤细胞耐药的关系  26-27
  1.3 MiRNA在癌症中的应用  27-30
    1.3.1 概述  27
    1.3.2 MiRNA在癌症诊断和预后中的应用  27-29
    1.3.3 MiRNA在癌症治疗中的应用  29-30
  1.4 研究目标、内容、创新点和意义  30-34
    1.4.1 研究目标  30
    1.4.2 研究内容  30-32
    1.4.3 研究意义和创新点  32-34
第2章 人结肠癌病例与细胞株中异常表达miRNA的研究  34-42
  2.1 引言  34
  2.2 材料与方法  34-37
    2.2.1 细胞株的培养  34-35
    2.2.2 人结肠癌及正常组织标本的收集及保存  35
    2.2.3 人结肠癌及正常组织标本的总RNA及miRNA提取  35
    2.2.4 miRNA芯片筛选人结肠癌病例与人正常结肠组织中异常表达的miRNA  35
    2.2.5 实时荧光定量PCR检验miRNA芯片结果  35-36
    2.2.6 实时荧光定量PCR检测人结肠癌细胞株中异常表达的miRNA  36
    2.2.7 统计分析  36-37
  2.3 实验结果  37-41
    2.3.1 不同病理分型的人结肠癌病例中miRNA的表达谱  37-38
    2.3.2 MiR-139-5p在34例人结肠癌病例组织中的表达量  38-39
    2.3.3 MiR-139-5p在6例人结肠癌细胞株中的表达量  39-40
    2.3.4 MiR-139-3p在34例人结肠癌病例组织中的表达量  40
    2.3.5 MiR-139-3p在6例人结肠癌细胞株中的表达量  40-41
  2.4 讨论  41-42
第3章 MiR-139-5p调控人结肠癌细胞增殖与浸润转移能力的研究  42-56
  3.1 引言  42
  3.2 材料与方法  42-45
    3.2.1 细胞株的培养  42-43
    3.2.2 MiRNA过表达质粒的构建  43
    3.2.3 实时荧光定量PCR检测细胞内miRNA表达量  43
    3.2.4 MTT实验检测细胞体外增殖能力  43-44
    3.2.5 Transwell小室实验检测细胞体外浸润转移能力  44
    3.2.6 细胞划痕愈合实验检测细胞体外迁移能力  44
    3.2.7 裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内增殖能力  44
    3.2.8 裸鼠肝脏转移实验检测细胞体内浸润转移能力  44-45
    3.2.9 H&E染色实验观察裸鼠肝转移灶  45
    3.2.10 统计分析  45
  3.3 实验结果  45-54
    3.3.1 MiR-139-5p表达量与人结肠癌患者临床病理特征的相关性  45-46
    3.3.2 MiR-139对人结肠癌细胞体外增殖能力的调控作用  46-48
    3.3.3 MiR-139对人结肠癌细胞体外浸润转移能力的调控作用  48-50
    3.3.4 MiR-139对人结肠癌细胞体内增殖能力的调控作用  50-52
    3.3.5 MiR-139对人结肠癌细胞体内浸润转移能力的调控作用  52-54
  3.4 讨论  54-56
第4章 MiR-139-5p靶基因IGF1R的相关研究  56-68
  4.1 引言  56-57
  4.2 材料与方法  57-60
    4.2.1 细胞株的培养  57
    4.2.2 生物信息学预测miR-139-5p靶基因  57
    4.2.3 人结肠癌及正常组织标本的收集及保存  57
    4.2.4 人结肠癌及正常组织标本的RNA提取  57
    4.2.5 实时荧光定量PCR检测人结肠癌病例中IGF1R的表达量  57-58
    4.2.6 实时荧光定量PCR检测miR-139的靶基因mRNA水平调控能力  58
    4.2.7 蛋白质印迹法检测miR-139的靶基因蛋白水平调控能力  58
    4.2.8 双荧光素酶报告基因法检测miR-139-5p与靶基因的结合位点  58-59
    4.2.9 MTT实验检测细胞体外增殖能力  59-60
    4.2.10 Transwell小室实验检测细胞体外浸润转移能力  60
    4.2.11 统计分析  60
  4.3 实验结果  60-66
    4.3.1 MiR-139-5p靶基因的预测  60-61
    4.3.2 MiR-139能够调控靶基因IGF1R的mRNA表达量  61-62
    4.3.3 MiR-139能够调控靶基因IGF1R的蛋白表达量  62
    4.3.4 MiR-139-5p通过作用于IGF1R的3'UTR调控靶基因IGF1R的表达  62-64
    4.3.5 IGF1R与miR-139-5p表达量在34例人结肠癌病例组织中的关联性  64
    4.3.6 IGF1R对人结肠癌细胞体外增殖能力的调控作用  64-65
    4.3.7 IGF1R对人结肠癌细胞体外浸润转移能力的调控作用  65-66
  4.4 讨论  66-68
第5章 MiR-139-5p调控人结肠癌细胞浸润转移的分子机理研究  68-78
  5.1 引言  68-69
  5.2 材料与方法  69-71
    5.2.1 细胞株的培养  69
    5.2.2 实时荧光定量PCR检测miR-139-5p对MMP-2和MMP-9的mRNA水平调控能力  69
    5.2.3 蛋白质印迹法检测miR-139-5p对MMP-2和MMP-9的蛋白水平调控能力  69
    5.2.4 明胶酶谱法检测miR-139-5p对MMP-2和MMP-9的蛋白活性调控能力  69-70
    5.2.5 双荧光素酶报告基因法检测miR-139-5p调控MMP-2启动子活性的能力  70-71
    5.2.6 蛋白质印迹法检测miR-139-5p调控下游MEK/ERK通路的能力  71
    5.2.7 人结肠癌及正常组织标本的收集及保存  71
    5.2.8 人结肠癌及正常组织标本的RNA提取  71
    5.2.9 实时荧光定量PCR检测病例中miR-139-5p,IGF1R和MMP-2的mRNA表达量  71
    5.2.10 统计分析  71
  5.3 实验结果  71-76
    5.3.1 MiR-139-5p能够调控MMP-2的mRNA表达量  71-72
    5.3.2 MiR-139-5p能够调控MMP-2的蛋白表达量  72-73
    5.3.3 MiR-139-5p能够调控MMP-2的蛋白活性  73
    5.3.4 MiR-139-5p能够调控MMP-2启动子的转录活性  73-74
    5.3.5 MiR-139-5p对靶基因IGF1R下游MEK/ERK信号通路的影响  74-75
    5.3.6 MMP-2,IGF1R和miR-139-5p表达量在34例人结肠癌病例组织中的关联性  75-76
  5.4 讨论  76-78
第6章 MiR-139-5p在人结肠癌细胞中异常低表达的分子机理研究  78-95
  6.1 引言  78-79
  6.2 材料与方法  79-82
    6.2.1 细胞株的培养  79
    6.2.2 人结肠癌及正常组织标本的收集及保存  79
    6.2.3 人结肠癌及正常组织标本的RNA提取  79
    6.2.4 实时荧光定量PCR检测人结肠癌病例中PDE2A的表达量  79
    6.2.5 实时荧光定量PCR检测人结肠癌细胞株中PDE2A的表达量  79
    6.2.6 实时荧光定量PCR检测人结肠癌病例中pre-miR-139的表达量  79
    6.2.7 实时荧光定量PCR检测PDE2A激活剂对pre-miR-139和PDE2A表达量的调控作用  79
    6.2.8 染色质免疫共沉淀法检测miR-139启动子结合因子  79-80
    6.2.9 实时荧光定量PCR检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂及DNA甲基化转移酶抑制剂对pre-miR-139和PDE2A的调控作用  80
    6.2.10 实时荧光定量PCR检测靶基因3'UTR对miR-139表达量的调控能力  80-81
    6.2.11 实时荧光定量PCR检测人结肠癌病例中ROCK2及RAP1B的表达量  81
    6.2.12 实时荧光定量PCR检测靶基因3'UTR对其他miRNA表达量的调控能力  81-82
    6.2.13 统计分析  82
  6.3 实验结果  82-93
    6.3.1 PDE2A与miR-139前体及成熟体表达量在34例人结肠癌病例组织中的关联性  82-83
    6.3.2 PDE2A表达量与人结肠癌患者临床病理特征的相关性  83-85
    6.3.3 PDE2A在6例人结肠癌细胞株中的表达量  85-86
    6.3.4 PDE2A激活剂对miR-139表达量的调控作用  86-87
    6.3.5 MiR-139具有独立启动子  87
    6.3.6 表观遗传学调控因素对miR-139表达量的影响  87-89
    6.3.7 Pre-miR-139在34例人结肠癌病例组织中的表达量  89-90
    6.3.8 靶基因3'UTR对miR-139-5p表达量的调控能力  90-91
    6.3.9 ROCK2及RAP1B表达量在34例人结肠癌病例组织中的关联性  91-92
    6.3.10 靶基因3'UTR对其他所结合miRNA表达量的调控能力  92-93
  6.4 讨论  93-95
第7章 MiR-139-5p靶基因间相互调控的分子机理研究及靶基因3’UTR生物学功能的研究  95-109
  7.1 引言  95-96
  7.2 材料与方法  96-98
    7.2.1 细胞株的培养  96
    7.2.2 蛋白质印迹法检测靶基因3'UTR的蛋白水平调控能力  96
    7.2.3 荧光素酶报告基因法检测靶基因3’UTR的调控能力  96-97
    7.2.4 实时荧光定量PCR检测miR-139-5p表达量  97
    7.2.5 蛋白质印迹法检测Dicer siNRA对靶基因蛋白表达量  97
    7.2.6 MTT实验检测细胞体外增殖能力  97
    7.2.7 软琼脂克隆形成法检测细胞体外增殖能力  97-98
    7.2.8 Transwell小室实验检测细胞体外浸润转移能力  98
    7.2.9 蛋白质印迹法检测靶基因3'UTR对自身及其它靶基因下游信号通路的调控能力  98
    7.2.10 统计分析  98
  7.3 实验结果  98-107
    7.3.1 MiR-139-5p靶基因IGF1R,ROCK2和RAP1B表达量在34例人结肠癌病例组织中的关联性  98-100
    7.3.2 MiR-139-5p靶基因3'UTR具有调控其他靶基因蛋白表达量的能力  100-102
    7.3.3 MiR-139-5p是靶基因间相互调控的关键信号分子  102-103
    7.3.4 MiR-139-5p靶基因3'UTR对人结肠癌细胞体外增殖能力的调控作用  103-105
    7.3.5 MiR-139-5p靶基因3'UTR对人结肠癌细胞体外浸润转移能力的调控作用  105-106
    7.3.6 MiR-139-5p靶基因3'UTR对其他靶基因下游信号通路的影响  106-107
  7.4 讨论  107-109
第8章 靶基因IGF1R逆转人结肠癌细胞多药耐药的分子机理研究  109-127
  8.1 引言  109-110
  8.2 材料与方法  110-112
    8.2.1 细胞株的培养  110
    8.2.2 人结肠癌多药耐药细胞对抗肿瘤药物耐药能力的测定  110
    8.2.3 蛋白质印迹法检测人结肠癌多药耐药细胞中相关耐药蛋白的表达量  110
    8.2.4 实时荧光定量PCR检测人结肠癌多药耐药细胞中IGF1R的mRNA表达量  110
    8.2.5 蛋白质印迹法检测人结肠癌多药耐药细胞中IGF1R的蛋白表达量  110
    8.2.6 MTT实验检肿瘤细胞体外增殖能力  110-111
    8.2.7 流式细胞仪检测细胞周期  111
    8.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡  111
    8.2.9 Hoechst染色法检测细胞凋亡  111
    8.2.10 原子光谱法检测细胞内铂离子含量  111
    8.2.11 高效液相色谱法检测细胞内长春新碱含量  111-112
    8.2.12 蛋白质印迹法检测IGF1R及其下游信号通路  112
    8.2.13 荧光素酶报告基因法检测MRP-2启动子活性  112
    8.2.14 实时荧光定量PCR检测MRP-2的mRNA表达量  112
    8.2.15 统计分析  112
  8.3 实验结果  112-124
    8.3.1 多药耐药细胞株的验证  112-114
    8.3.2 IGF1R在人结肠癌多药耐药细胞中的表达量  114-115
    8.3.3 IGF1R对人结肠癌多药耐药细胞体外增殖能力的调控作用  115-116
    8.3.4 IGF1R对人结肠癌多药耐药细胞细胞周期的影响  116-117
    8.3.5 IGF1R可以调节人结肠癌多药耐药细胞的凋亡并及对抗肿瘤药物的敏感性  117-120
    8.3.6 IGF1R下游信号通路调控人结肠癌多药耐药细胞对抗肿瘤药物敏感性的能力  120-122
    8.3.7 IGF1R能够调控MRP-2的转录活性  122-124
  8.4 讨论  124-127
第9章 MiR-139-5p逆转人结肠癌细胞多药耐药的分子机理研究  127-139
  9.1 引言  127
  9.2 材料与方法  127-129
    9.2.1 细胞株的培养  127
    9.2.2 实时荧光定量PCR检测人结肠癌多药耐药细胞中miR-139-5p的表达量  127
    9.2.3 MTT实验检测细胞体外增殖能力  127-128
    9.2.4 克隆形成法检测细胞体外增殖能力  128
    9.2.5 MTT实验检测细胞对抗肿瘤药物敏感性  128
    9.2.6 流式细胞仪检测肿瘤干细胞表面标志物表达量  128
    9.2.7 蛋白质印迹法检测miR-139的靶基因蛋白水平调控能力  128
    9.2.8 双荧光素酶报告基因法检测miR-139-5p与靶基因的结合位点  128
    9.2.9 统计分析  128-129
  9.3 实验结果  129-137
    9.3.1 MiR-139-5p表达量在人结肠癌多药耐药细胞中的表达量  129
    9.3.2 MiR-139-5p对人结肠癌多药耐药细胞体外增殖能力的调控作用  129-130
    9.3.3 MiR-139-5p可以调节人结肠癌多药耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性  130-132
    9.3.4 结肠癌多药耐药细胞具有肿瘤干细胞特性  132-134
    9.3.5 MiR-139-5p通过作用于Notch-1的3'UTR调控靶基因Notch-1的表达  134-135
    9.3.6 Notch-1可以调节人结肠癌多药耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性  135-137
  9.4 讨论  137-139
第10章 结论  139-141
参考文献  141-165
致谢  165-166
在读期间发表论文和专利情况  166-167

相似论文

  1. 超声处理RTM成型酚醛/乙醇在石英纤维表面的竞争吸附,TB332
  2. 基于改进蚁群算法的机器人路径规划研究,TP242
  3. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  4. Slug对P53-MDM2系统的调控作用,R730.2
  5. 磷酸化介导的UGT1A3代谢活性差异的初步研究,R346
  6. 产业技术转移与承接中的环境伦理问题探析,X2
  7. 高性能聚丙烯腈的合成与表征,O631.3
  8. GMA的ATRP聚合及立构规整性的研究,O631.3
  9. 小菜蛾APN和Pxbre基因的克隆与mRNA表达,S433.4
  10. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  11. 小麦UDP-葡萄糖基转移酶基因Ta-UGT3的表达载体构建和转化小麦研究,S512.1
  12. 阿斯匹林、姜黄素对人HT-29、SW480细胞中β-catenin、COX-2及PGE2的影响,R735.35
  13. 阿司匹林对人结肠癌细胞株HT-29、SW-480中肿瘤干细胞相关标记物的影响,R735.35
  14. 虎纹捕鸟蛛粗毒对人结肠癌SW480细胞体外增殖的影响,R735.35
  15. Myotrophin在胃癌细胞株SGC7901和SGC7901/ADR中表达的差异性研究,R735.2
  16. 硅化合物SILA409对人小细胞肺癌GRP78表达及与VP-16耐药的研究,R734.2
  17. 微波消融联合5-FU对小鼠结肠癌移植瘤治疗的实验研究,R735.35
  18. 青岛市工业大气污染防治制度研究,X51
  19. 应用抑制性差减杂交技术分离白血病多药耐药相关基因,R733.7
  20. 舌鳞状细胞癌不同浸润方式ki67表达及DNA倍体研究,R739.86
  21. 阿托伐他汀联合塞来昔布对人结肠癌SW-480细胞增殖和凋亡的影响,R965

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 结肠肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com