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常染色体及X染色体STR在乳腺癌及妇科肿瘤组织中的变异分析

作　者: 孙丽娟
导　师: 丛斌
学　校: 河北医科大学
专　业: 法医学
关键词: 法医物证学妇科肿瘤乳腺癌短串联重复序列常染色体 X染色体基因变异
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：在法医学实践中常会遇到一些特殊案例，肿瘤组织（通常为甲醛固定石蜡包埋组织）成为唯一的参照样本。然而肿瘤组织存在STR变异，使同一个体肿瘤组织与正常组织分型不一致。本研究旨在探讨妇科肿瘤组织和乳腺癌组织的常染色体和X染色体STR变异类型和规律，为此类肿瘤组织在法医学实践中的应用奠定基础。方法：1样本采集：分别采集经病理学诊断明确的63例乳腺癌和62例妇科恶性肿瘤患者的肿瘤组织和癌旁正常组织，以及10例妇科良性肿瘤组织及正常对照组织。其中40例妇科肿瘤样本包含对应的外周血。同时记录患者的年龄、肿瘤类型、组织类型、临床分期、分化程度等信息。2DNA提取：分别用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取妇科肿瘤和乳腺癌的肿瘤组织、癌旁正常组织DNA，用血液基因组小量提取试剂盒提取血液基因组DNA。用ND-1000蛋白核酸定量仪定量。3STR分型：采用PowerPlex21System和Argus X-12试剂盒分别扩增DNA，共33个STR基因座。ABI3130Genetic Analyzer对PCR产物进行电泳分型，使用GeneMapper v3.2分析结果，得到肿瘤组织、正常组织和血液的STR分型。对比同一个体正常组织与血液的DNA分型和同一个体的肿瘤组织与正常组织的DNA分型，记录STR变异位点和类型。4STR变异验证：用重复实验、不同试剂盒间相互验证和单基因座扩增方法验证STR变异的发生并对等位基因测序确认其发生的机制。5显微切割：挑选存在STR变异的部分妇科肿瘤组织进行显微切割，对切取的肿瘤细胞和正常间质提取DNA，扩增并电泳分型，分别对比肿瘤细胞、正常间质细胞、肿瘤组织、正常组织DNA分型。6统计学分析：应用Excel、SPSS v16.0软件对上述实验结果进行统计学分析，用计数法分析各种变异类型的个体水平STR变异率和基因座水平STR变异率，用χ2检验比较不同肿瘤类型、组织类型、分化程度及临床分期的STR变异差异及妇科肿瘤和乳腺癌组织STR变异的差异。结果：1妇科肿瘤组织STR变异比较妇科肿瘤患者血液样本和正常对照组织的STR分型结果发现，血液样本与正常组织的STR分型一致，证实外周血液的STR分型无变异。在妇科肿瘤组织中，观察到增加等位基因（additional alleles, Aadd）、新等位基因（new alleles, Anew）、完全杂合性丢失（complete loss ofheterozygosity, LOH）和部分杂合性丢失（partial loss of heterozygous,pLOH）4种STR变异类型。前三种可引起基因型改变（STRGA）导致误判。抽取部分确定STR变异的样本进行单基因座PCR扩增、测序，测序得到的等位基因与试剂盒分型结果一致。经过单个等位基因测序，发现大部分突变来自于重复单位数目的变化，多为整步突变，突变增长与减少均可见，符合复制滑脱机制。统计分析结果显示，妇科肿瘤组织STR中，各变异类型的STR变异率不同，三种导致基因型改变的STR变异类型的个体检出率无显著差异，而基因座检出率在常染色体STR和33个STR中具有显著差异（P<0.01）。妇科肿瘤组织中，33个STR基因座的变异率范围为0~9.68%，常染色体STR变异检出率最高的基因座有Penta E、D5S818、FGA，分别为6.45%、9.68%、8.06%，X-STR以DXS10146的变异检出率最高，为9.68%。在性别基因座AMEL、Penta D和HPRTB基因座未发现STR变异，其他基因座的STR变异率均大于DNA的平均突变率，影响等位基因的正确分型。检验结果显示，两种遗传标记的STR变异无显著性差异，亦无相关性。经过χ2检验分析发现，在常染色和X染色体，不同肿瘤类型、组织类型和分化程度的妇科肿瘤组织的STR变异均无显著性差异。然而，由于良性肿瘤组织的STR基因座未发现变异，比较良、恶性妇科肿瘤组织的常染色体STR变异的差异具有统计学意义（P=0.029）。在X-STR中，两者的STR变异无显著性差异（P=0.108）。综合比较常染色体和X染色体STR变异发现，良、恶性妇科肿瘤组织的STR变异具有显著差异（P<0.01）。秩和检验分析结果显示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个临床分期妇科肿瘤的常染色体STR、X-STR变异无显著性差异。2乳腺癌组织STR变异通过对比发现乳腺癌组织中也检测到4种STR变异类型，且各类型检出率存在差异。检验结果显示，三种导致基因型改变的STR变异类型的个体检出率和基因座检出率在常染色体STR和33个STR中无显著性差异，但是在X-STR的差异具有统计学意义（P<0.01），Aadd检出率最高，LOH检出率最低。在乳腺癌中，各STR基因座变异率范围是0~4.76%，发生STR变异的基因座较少，常染色体发生STR变异的基因座数低于X-STR。检验结果显示，两种遗传标记的STR变异无显著性差异，亦无相关性。经χ2检验分析发现不同分化程度的乳腺癌组织常染色STR变异差异具有统计学意义。而X染色体及综合33个基因座的STR变异无显著差异。秩和检验结果显示，三个临床分期乳腺癌组织的STR变异差异无统计学意义。3妇科肿瘤组织和乳腺癌STR变异差异观察妇科肿瘤组织和乳腺癌的基因座水平的STR变异率发现，妇科肿瘤发生STR变异的基因座数显著高于乳腺癌，妇科肿瘤的基因座变异率也相对高于乳腺癌的同一基因座的变异率。在妇科肿瘤中变异多发生于常染色体STR基因座，而乳腺癌中X-STR变异更常见。经χ2检验分析结果显示，两种肿瘤的常染色体STR基因座变异存在显著性差异（P=0.003），而两种肿瘤在X染色体基因座的STR变异无显著性差异（P=0.179）。4显微切割DNA分型结果DNA分型结果显示，间质细胞与正常对照组织的DNA分型结果一致，肿瘤细胞与肿瘤组织的DNA分型存在差异。肿瘤细胞中只观察到3种STR变异类型：Anew、LOH和pLOH，而且检出LOH的数目多于相应的肿瘤组织。结论：1在常染色体STR和X-STR系统中，妇科肿瘤组织的STR基因座变异检出率、个体变异检出率显著高于乳腺肿瘤组织，乳腺癌组织的司法实践应用价值大于妇科肿瘤组织。2在妇科肿瘤组织中，除AMEL、Penta D和HPRTB基因座外，其余基因座均检测到STR变异，说明此33个法医学常用的STR基因座在妇科肿瘤组织中的稳定性较差，不适合应用于该系统肿瘤组织的个体识别和亲子鉴定。3本研究筛选出在乳腺肿瘤中未检测到变异的16个常染色体STR和4个X-STR基因座，可作为乳腺肿瘤个体识别的备选基因座，指导在大样本人群中深入研究。4乳腺癌组织的常染色体STR基因座变异与肿瘤的分化程度有关，分化程度低的肿瘤组织STR变异率高，提示在实际检案中遇到此类肿瘤组织的检验需谨慎。5通过显微切割技术可以准确分离出肿瘤组织中的正常间质细胞，能够代表肿瘤来源个体的正常DNA分型，是解决肿瘤组织身源鉴定的一种有效方法，适用于肿瘤细胞和间质细胞分界清楚的肿瘤组织。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-13
英文缩写  13-14
前言  14-15
材料与方法  15-26
结果  26-31
附图  31-43
附表  43-51
讨论  51-55
结论  55
参考文献  55-58
综述肿瘤患者来源生物学检材的法医学鉴定  58-70
  参考文献  65-70
致谢  70-71
个人简历  71

常染色体及X染色体STR在乳腺癌及妇科肿瘤组织中的变异分析

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