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IGFBP-4保护下肢缺血性损伤的实验研究

作　者: 彭锦辉
导　师: 钱齐荣
学　校: 第二军医大学
专　业: 外科学
关键词: IGFBP-4 下肢缺血 DNA损伤 Wnt信号通路
分类号: R654.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

下肢缺血性疾病是周围血管疾病（peripheral artery disease, PAD）中最常见的疾病，甚至可以发展成严重肢体缺血，许多病人最后不得不承受着截肢的痛苦，这些患者的生活质量评分甚至比癌症患者、慢性心脏病患者的评分还低。目前临床上治疗下肢缺血的方法主要是药物治疗和手术治疗等，但是效果仍不满意。在下肢缺血病理过程中，血管阻塞后致下肢发生缺血、缺氧性改变，产生大量的氧自由基，从而导致DNA损伤的发生。而γ-H2AX的形成是DNA双链断裂的一个标志，伴随DNA损伤的发生而出现。研究显示Wnt信号通路在下肢缺血损伤修复过程中扮演着十分重要的角色，而Wnt信号通路的激活与DNA损伤之间有着十分密切的关系，这就促使我们去研究Wnt经典途径抑制后是否会导致DNA损伤的减少，从而起到保护下肢缺血后损伤的作用。最近的研究表明胰岛素样生长因子结合蛋白-4（Insulin like growth factor bindingproteins-4，IGFBP-4）是强有力的Wnt经典通路抑制剂，本研究对IGFBP-4和DNA损伤的关系及其在下肢缺血损伤修复过程中的作用进行了探讨和研究，旨在发现IGFBP-4对于减少下肢缺血性疾病损伤的重要作用，并为临床治疗提供初步的思路。本研究主要内容如下：目的：探讨IGFBP-4在下肢缺血性疾病中的保护作用，并阐明其具体作用机制，为进一步的临床治疗提供理论依据。方法：1、通过体外实验，用双氧水刺激诱导细胞发生DNA损伤，检测IGFBP-4对DNA损伤的保护作用；再通过LiCl（Wnt经典途径的激动剂）刺激和敲除β-catenin（Wnt经典信号通路过程中一个重要分子），验证IGFBP-4对双氧水引导的DNA损伤的保护作用是否通过抑制Wnt经典途径来实现的。2、在体内实验中，结扎小鼠下肢股动脉造成下肢缺血模型，将IGFBP-4、PBS(Phosphate Buffer Solution,PBS)局部注射后，使用Laser Doppler及病理切片观察IGFBP-4对下肢缺血是否具有保护作用；再通过Western Blot来验证该保护作用是否通过抑制Wnt经典途径减少DNA损伤来实现的。结果：在体外实验中，双氧水刺激人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical VeinEndothelial Cells,HUVEC）能够引起其发生γ-H2AX的升高，即导致细胞发生了DNA损伤；IGFBP-4能够导致HUVEC的β-catenin表达逐渐下调，即阻止的Wnt经典信号通路，LiCl则引起β-catenin表达逐渐上调，即激活了细胞的Wnt经典信号通路；IGFBP-4预处理HUVEC后能够减少双氧水引起的DNA损伤，而LiCl则增加了DNA损伤。同样，在小鼠体内实验中，Laser Doppler和病理结果显示在下肢缺血模型建立后，注射IGFBP-4组的小鼠下肢损伤程度较对照组要轻；Western Blot的结果表明IGFBP-4注射的小鼠组织β-catenin表达水平较注射PBS的小鼠要低，并且γ-H2AX的表达也低，即DNA损伤程度轻。结论：1、在体外，IGFBP-4能够保护H2O2引导的DNA损伤；2、在体外， IGFBP-4是通过抑制Wnt经典信号通路从而减少H2O2刺激引导的DNA损伤；3、在小鼠体内，IGFBP-4能够保护下肢缺血性损伤导致的DNA损伤；4、在小鼠体内，IGFBP-4也是通过抑制Wnt经典信号通路从而减少小鼠下肢缺血性损伤导致的DNA损伤。

IGFBP-4保护下肢缺血性损伤的实验研究

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