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丙烯酰胺( acrylamide )是广泛用于生产化工产品聚丙烯酰胺的白色晶体物质,常用于净化处理水,加工纸浆等。淀粉类食品在高温(>120℃)烹调下容易产生丙烯酰胺,人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺。油炸和烧烤的淀粉类食品,如油条,油饼,炸薯条等含有的丙烯酰胺含量,比世界卫生组织(WHO)规定的饮用水允许最大限量(0.5μg/L)高出500多倍[1]。动物实验研究表明丙烯酰胺主要引起神经毒性,还有生殖及发育毒性,但在人类主要表现为神经毒性。神经毒性主要为周围神经和中枢神经系统的退行性变,急性或亚急性中毒以中枢神经系统障碍为主,慢性中毒以周围神经病为主,目前具体作用机制未完全阐明。褪黑素(melatonin,MT)是松果体分泌的主要激素,可调节情绪、睡眠、免疫、性行为及生殖等多种生理功能,也可调控衰老,肿瘤生长和某些老年病的发生及发展。上世纪90年代,报道称MT是一种高效的自由基清除剂,具有极强的水溶性及脂溶性,可以穿过体内多种生理屏障,能有效清除过氧烷自由基、羟自由基、超氧阴离子等,降低体内的氧化损伤以及上调抗氧化酶的活性,可用于防止老年性痴呆(AD)、神经退行性病变帕金森病(PD)以及亨廷顿病等方面。本研究在ACR亚急性染毒导致大鼠神经行为损伤的基础上,研究MT同时干预对ACR所致神经行为的损伤,中枢神经系统氧化损伤以及DNA损伤的影响,以探讨丙烯酰胺亚急性中毒特征及可能的中毒机制,为探索防治丙烯酰胺中毒的方法提供实验依据。第一部分MT干预前后ACR对大鼠神经行为毒性的影响目的:探讨MT同时干预前后ACR染毒对大鼠神经行为毒性的影响。方法:动物分4个组,分别为对照组,ACR组(40 mg/kg),MT组(5 mg/kgMT),MT+ACR组(5 mg/kgMT+ 40 mg/kgACR),每组9只。每天上午10:00,ACR组以40 mg/kg ACR灌胃染毒,对照组灌胃等容量的生理盐水,MT组腹腔注射5 mg/kg MT,MT+ACR组腹腔注射5 mg/kg MT并同时灌胃40 mg/kg ACR,连续12d,于第0,3,6,9,12 d测取动物的体重,步态分值,甩尾时间,后肢撑力等。第12 d灌胃24 h后,各组大鼠均断头处死,在冰盘上分离大脑皮层,小脑及坐骨神经,预冷PBS缓冲液洗净,干净滤纸吸干后置于新鲜配制的福尔马林固定液中,进行HE染色。结果:(1)与对照组相比,ACR组的大鼠体重于第3 d、第6 d、第9 d、第12 d分别下降9.4%(P <0.05)、12.2%(P <0.01)、16.3%(P <0.01)、23.8%(P <0.01);MT+ACR组于第6 d、第9 d、第12 d分别下降8.9%(P <0.05)、8.8%(P <0.05)、15.8%(P <0.01)。与ACR组相比,MT+ACR组于第9 d、第12 d分别增长8.9%(P <0.05)、10.6%(P <0.05)。(2)在第3~12 d,ACR组和MT+ACR组的步态分值明显高于对照组(P <0.01)。与ACR组相比,第6 d,MT+ACR组的步态减轻25.1% (P <0.01),第9 d减低20%(P <0.01)。(3)与对照组相比,ACR组的甩尾时间于第9 d,第12 d分别缩短26.4%(P <0.01),55%(P <0.01),MT+ACR组的甩尾时间于第9 d,第12 d分别缩短26.4%(P <0.01),33.3%(P <0.01)。第12 d,与ACR组相比,MT+ACR组的甩尾时间延长48.1%(P <0.01)。(4)随着染毒时间的延长,ACR组的后肢撑力指数呈明显的增大趋势,MT+ACR组呈轻微的增大趋势。与对照组相比,ACR组从第6 d开始后肢撑力指数明显增大(P <0.01),MT+ACR组从第9 d开始后肢撑力指数增宽,差异有显著性意义(P <0.01)。第6 d,与ACR组相比,MT+ACR组的后肢撑力指数缩短19.6%(P <0.01)。(5)HE染色结果显示,大脑皮层及坐骨神经各组之间未见异常病变,小脑的ACR组可见浦肯野细胞核固缩等异常病变,MT+ACR组未见异常病变。结论:ACR亚急性染毒可导致大鼠的神经行为损伤,表现为体重下降,步态分值及后肢撑力指数增高,甩尾时间缩短等,从形态结构上观察主要为小脑浦肯野细胞的核固缩。MT同时干预可缓解大鼠的中毒症状,减轻ACR对神经行为的影响和小脑结构的损伤。第二部分MT干预前后ACR对大鼠脑组织的氧化损伤目的:探讨MT干预前后ACR对大鼠的大脑皮层及小脑组织氧化损伤的影响。方法:动物分组及处理同第一部分。全能酶标仪比色法测定大鼠大脑皮层和小脑组织的丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。结果:(1)大脑皮层结果显示,与对照组相比,ACR组的T-SOD活性降低了9.94%(P <0.05),GSH含量降低了19.90%(P <0.01);与ACR组相比,MT+ACR组的T-SOD活力升高了15.67%(P <0.01)。(2)小脑结果显示,与对照组相比,ACR组MDA含量升高了20.36%(P <0.05),T-SOD活性,GSH含量,分别下降18.33%(P <0.05),20.67%(P <0.01)。与ACR组相比,MT+ACR组小脑的MDA含量下降20.51%(P <0.01)。结论:ACR亚急性染毒可对大鼠脑组织造成氧化损伤,以小脑的脂质过氧化表现较为突出,而大脑皮层的脂质过氧化损伤并不明显。MT同时干预对ACR染毒致大鼠的氧化损伤有拮抗作用。氧化损伤可能介导ACR的神经毒作用。第三部分MT干预前后ACR对大鼠脑组织的DNA损伤目的:探讨MT干预前后ACR对大鼠大脑皮层及小脑细胞DNA损伤的影响。方法:动物分组及处理同第一部分。制备大脑皮层及小脑的单细胞悬液,调整细胞浓度为1×106/ml,采用单细胞凝胶电泳技术测定大脑皮层和小脑细胞的DNA损伤情况。结果:(1)大脑皮层结果显示,各组之间的彗星尾长,尾部DNA百分含量及Olive尾距均无统计学差异(P >0.05)。(2)小脑结果显示,与对照组相比,ACR组及MT+ACR组的尾长,尾部DNA百分含量及Olive尾距均显著性增加(P <0.01);与ACR组相比,MT+ACR组的尾长降低了39.1%(P <0.01),尾部DNA百分含量下降52.1%(P <0.01),Olive尾距降低56.8%(P <0.01)。结论: ACR亚急性染毒能引起大鼠小脑细胞的DNA损伤,未观察到大脑皮层细胞的DNA损伤, MT同时干预可减轻ACR对小脑细胞的DNA损伤,但仍未恢复到对照水平。综上所述,ACR亚急性经口中毒模型造成了大鼠神经功能的损伤及小脑的结构病变,ACR对神经系统的损伤以功能损伤为主,结构损伤为辅。对生物大分子的损伤表现为小脑的脂质过氧化损伤及DNA损伤,大脑皮层的脂质过氧化损伤不明显,未观察到大脑皮层的DNA损伤,MT同时干预可以缓解ACR的神经毒作用。氧化损伤可能介导ACR的神经毒作用,小脑的脂质过氧化损伤可能与结构损伤有关,也可能与自由基或活性氧增多有关。小脑的DNA损伤可能是因为ACR诱导产生大量的自由基或活性氧,直接攻击DNA导致氧化损伤。也可能是因为小脑的脂质过氧化损伤引起神经细胞膜的通透性改变,使膜性结构受到破坏,诱发DNA损伤,具体作用机制有待于进一步研究。
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