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sFRP1-Fc、WIF1-Fc真核表达载体的构建及对肝癌作用的初步研究

作　者: 黄青红
导　师: 钱程
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Wnt信号通路拮抗剂 CHO表达系统 ΦC31整合酶系统 肝癌
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景:Wnt信号通路作为动物发育中关键的信号途径,参与从线虫到人类等不同物种的胚胎发育过程及成体正常结构代谢的维持,是一条多环节、多作用位点的开放通路。该转导途径在人类不同肿瘤中能广泛激活调节细胞的生长、迁移和分化,参与了乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、食管癌及皮肤癌等多种癌症的发生和演变过程,是公认的肿瘤发生过程中的关键信号通路之一,因而在肿瘤、干细胞及发育生物学研究中越来越显现出其潜在影响。近年来研究表明,Wnt信号通路上多数蛋白的异常均有可能与癌症的发生相关。因此,针对性开发靶向该信号通路异常的药物已成为癌症治疗的潜在方向。目的:分别构建含Wnt信号通路抑制因子sFRP1(Secreted frizzled-related protein 1)-Fc(免疫球蛋白IgG的Fc片段)及WIF1(Wnt inhibitory factor 1)-Fc的新型真核表达载体,该表达载体携带ΦC31整合酶整合位点attB,能与含attP位点或pseudo-attP位点的DNA序列进行特异性重组,不仅可以提高克隆效率,也可以应用于外源目的基因在细胞染色体上的整合介导的基因治疗。重组质粒的多克隆位点前含绝缘子序列,可以降低因整合位点导致的基因不稳定表达概率,基因不稳定表达会导致表达产物产量降低。探究重组质粒是否能在CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞中高效克隆及表达,分别检测其对人癌细胞的抑制增殖和促凋亡作用,以期获得一种新型的能多方面治疗癌症的方法。方法:构建四个重组质粒pcHS(含全部绝缘子序列)-sFRP1-Fc、pcHScore(含核心绝缘子序列)-sFRP1-Fc、pcHS-WIF1-Fc和pcHScore-WIF1-Fc分别转染CHO细胞观察ΦC31整合酶提高整合的效率。进行单克隆筛选和扩大培养,分别检测融合蛋白的表达量。将上述四个重组质粒分别转染人肝正常细胞和肝癌细胞,观察其对人肝癌细胞的影响,研究重组质粒的表达能力及肿瘤杀伤效果。结果:含融合基因的四个重组质粒均能在CHO中形成稳定的阳性单克隆,且稳定表达融合蛋白。共整合转染质粒,较无整合酶质粒共转染的的对照组,其阳性克隆效率显著提高,蛋白表达量明显增加。重组质粒能有效抑制Wnt信号通路,抑制肿瘤细胞生长。结论:成功构建了pcHS-sFRP1-Fc、pcHScore-sFRP1-Fc、pcHS-WIF1-Fc和pcHScore-WIF1-Fc四个真核重组表达质粒,表达并纯化了融合蛋白。上述四个质粒均能有效抑制Wnt信号通路,从而对癌细胞的生长起到抑制作用。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略语  12-17
第一章 前言  17-26
  1 Wnt 信号通路研究进展  17-20
    1.1 Wnt 信号通路的分类与各组分作用  17-18
      1.1.1 Wnt 信号通路的信号路径  17-18
    1.2 Wnt 信号通路与肿瘤的关系  18-20
      1.2.1 Wnt 信号通路异常引起细胞细胞增殖机制  18-19
      1.2.2 Wnt 信号通路拮抗蛋白基因甲基化与肝细胞癌发生  19-20
      1.2.3 Wnt 信号通路拮抗蛋白sFRP1 甲基化与肿瘤的发生  20
      1.2.4 Wnt 信号通路拮抗蛋白WIF1 甲基化与肿瘤的发生  20
  2 癌症的基因治疗  20-24
    2.1 基因治疗的基因转移载体  21-23
    2.2 φC31 整合酶在癌症基因治疗中的作用  23-24
  3 CHO 表达系统  24-25
    3.1 真核表达系统的优势  24-25
      3.1.2 CHO 表达系统的优势  24-25
      3.1.3 CHO 细胞的改造及表达载体的优化  25
  4 课题来源  25-26
第二章 真核表达载体质粒pcHS-wif1-Fc、pcHS-Sfrp1-Fc、pcHScore-wif1-Fc、pcHScore-Sfrp1-Fc 的构建  26-41
  1 实验试剂、设备与耗材  26-29
    1.1 试剂  26-28
      1.1.1 试剂与耗材来源  26-27
      1.1.2 试剂配制  27-28
        1.1.2.1 小抽所用试剂  27-28
    1.2 实验设备  28-29
  2 实验方法  29-36
    2.1 实验设计及实验流程  29-30
    2.2 实验步骤  30-36
      2.2.1 感受态细胞的制备( CaCl_2 法)  30
      2.2.2 转化测定转化效率  30
      2.2.3 计算转化率  30-31
      2.2.4 质粒的转化  31
      2.2.5 质粒PcHS-GFP、pcHScore-GFP、pad-track-wif1-Fc、pad-track-sfrp1-Fc 的小剂量抽提  31-32
      2.2.6 质粒的大剂量抽提与保存  32-33
      2.2.7 质粒PcHS-GFP、pcHScore-GFP 的酶切鉴定  33
      2.2.8 基因sFRP1-Fc、WIF1-Fc 的PCR 法获得  33-34
      2.2.9 PCR 产物的核酸电泳鉴定  34-35
      2.2.10 PCR 产物凝胶回收的回收  35
      2.2.11 质粒片段pcHS,pcHScore 的酶切  35-36
      2.2.12 质粒酶切片段的回收  36
      2.2.13 质粒片段的连接  36
      2.2.14 重组质粒的转化、小抽、及凝胶电泳鉴定  36
  3 实验结果  36-41
    3.1 PCR 结果  36-37
    3.2 连接T 载体测序  37-38
    3.3 连接T 载体后用AgeI、XhoI 双酶切结果图  38
    3.4 质粒片段pcHS 和pcHScore 的获得  38-39
    3.5 表达载体pcHS-sFRP1-Fc、pcHScore-sFRP1-Fc、pcHSWIF1-Fc、pcHScoreWIF1-Fc 的构建  39
    3.6 质粒pcHS-sFRP1-Fc、pcHScore-sFRP1-Fc、pcHSWIF1-Fc、pcHScoreWIF1-Fc 的鉴定  39-40
    3.7 质粒结构示意图  40
    3.8 所构建质粒的大抽与定量  40-41
第三章 融合蛋白sFRP1-Fc、WIF1-Fc 的表达和纯化  41-53
  1 实验试剂、设备与耗材  41-45
    1.1 实验试剂  41-43
      1.1.1 试剂来源实验耗材来源  41
      1.1.2 试剂配制  41-43
        1.1.2.1 细胞培养所需试剂  41-42
        1.1.2.2 蛋白纯化所用试剂  42
        1.1.2.3 蛋白电泳相关试剂  42-43
    1.2 实验设备  43-45
  2 实验方法  45-49
    2.1 实验设计流程  45
    2.2 实验步骤  45-49
      2.2.1 CHO 细胞的复苏  45-46
      2.2.2 细胞的传代  46
      2.2.3 细胞的计数与铺板  46
      2.2.4 细胞的冻存  46-47
      2.2.5 G418 对CHO 细胞最小致死量的评测（Neo 抗性筛选）  47
      2.2.6 表达载体克隆率的测定  47-48
      2.2.7 单克隆的筛选及扩大培养  48
      2.2.8 真核表达载体表达效率的测定  48
      2.2.9 Western-blot 鉴定表达蛋白  48-49
  3 实验结果  49-53
    3.1 G418 筛选浓度的确定  49-50
    3.2 整合有目的基因的CHO 单克隆的筛选  50
    3.3 ΦC31 整合酶提高整合效率的测定  50-51
    3.4 表达载体表达能力的测定  51-53
第四章 真核表达载体对肝癌细胞的作用研究  53-62
  1 实验材料  53-54
    1.1 实验设备耗材与试剂  53-54
  2 实验方法  54-58
    2.1 实验设计及流程  54-55
    2.2 实验步骤  55-58
      2.2.1 结晶紫染色法测质粒对细胞增殖的抑制  55
      2.2.2 检测基因sFRP1-Fc,WIF1-Fc 对细胞增殖抑制  55
      2.2.3 Hoechst 染色法测质粒的促凋亡作用  55-56
      2.2.4 Western-blot 检测法测对癌细胞的影响  56
        2.2.4.1 总蛋白定量（BCA 法）  56
      2.2.5 Real-time 检测法  56-58
        2.2.5.1 铺板与转染  56
        2.2.5.2 细胞总RNA 的提取  56-57
        2.2.5.3 cDNA 的合成  57
        2.2.5.4 realtime-PCR 检测细胞内相关基因mRNA 丰度  57-58
  3 实验结果  58-62
    3.1 结晶紫染色观察真核表达质粒对肝癌细胞的增殖抑制作用  58-59
    3.2 hoechst 染色法观察携带有目的基因的载体对细胞的促凋亡作用  59
    3.3 western-blot 法检测细胞内信号通路的变化  59-60
    3.4 Real-time 检测suvivin,bcl-2,ctclinD1,c-myc 转录丰度  60-62
第五章 结论与讨论  62-64
参考文献  64-67

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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